现有的细胞增殖和细胞毒性检测相关的实验方法种类繁多，准确性、经济性、可操作性不一，而且部分实验受限于实验室条件无法开展。选对适合的实验方法，不仅可以少走弯路、事半功倍、节省有限的经费和实验资源，而且有助于建立稳定精准的技术平台和进一步推进相关的研究。因此，本文对常见细胞增殖及细胞毒性检测的方法进行了汇总及比较。

1.CCK⁃8法

将处于对数生长期的细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，每个检测时间点设置5个复孔，每孔100μL培养体系。96孔板四周加入PBS以防止板中的细胞培养液蒸发。在37 ℃、5% CO2培养箱培养不同时间后，每孔分别加入10μL CCK-8试剂，以100μL细胞悬液+10μL CCK-8体系进行孵育。预实验确定最佳孵育时间，随后在培养箱中孵育一段时间后使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，OD（450 nm）_实验组-OD（450 nm）_空白对照的值间接反映活细胞的数量。空白对照指仅有培养液而未加细胞的孔。

2.EdU标记法

用培养基调整细胞密度为1×10⁶个/mL进行EdU标记，预实验确定加入EdU的浓度为50μmol/L，培养箱孵育2 h。经4%多聚甲醛固定15 min和0.5% Triton X-100通透5 min处理后，每 1×10⁶个细胞加入500μL现配的Click-iT反应混合物避光染色30 min后加入DAPI室温避光15 min进行核染色。使用流式细胞仪或者荧光显微镜检测与分析 EdU阳性的细胞占比。

3.CFSE标记法

将细胞用PBS洗涤1遍并重悬。2×10⁶个/mL的细胞悬液加入1μL 5 mmol/L的 CFSE储存液，配制5μmol/L的工作液。37 ℃避光孵育10 min后，加入4℃预冷的5倍体积含血清的细胞培养液终止染色，5 min后离心，并用PBS洗2遍后，加入培养基继续培养。分别于CFSE 标记后的不同时间点用流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度，扩增后与扩增前的平均荧光强度比值反映细胞的扩增倍数。

4.3种细胞增殖检测方法的比较

1.Calcein-AM/CellTracker Deep Red活细胞染料双标流式法

用培养基将细胞调整为1×10⁶个/mL，分别加入Calcein-AM 至终浓度2μmol/L、CellTracker Deep Red Dye至终浓度0.1 μmol/L，37℃避光孵育30 min后，PBS清洗2遍后用培养基将细胞密度调整为2×10⁵个/mL，加入96孔U型底板，每孔加入100μL；向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质（药物、化学试剂等待检测物质），并定容至200μL。将培养板置于1 000 r/min离心1 min，放入37℃培养箱静置4 h进行杀伤后，吹匀细胞，用流式细胞仪上样，注意进样相同体积数的分组样品。双阳性细胞群为剩余活的细胞。设置阳性对照：标记过的细胞不加材料。细胞毒性（%）=（空白对照读数-实验组读数）/空白对照读数×100%。

2.荧光素酶法

将细胞的密度调整为1×10⁵个/mL。然后铺96孔板，每孔加细胞悬液100μL，向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质（药物、化学试剂等待检测物质），空白对照不加材料，并定容至200μL。放置培养箱4 h后。按照每孔50μL用量，将2 mg/mL ATP溶液与300 ng/mL荧光素钠溶液按照1∶3配制发光底物混合液。取出孵育过后的96孔板，每孔加入50μL 2% Triton X-100，吹打混匀室温静置5 min，再次吹打混匀后每孔吸出50μL 转移到黑色96孔酶标板，并加入50μL发光底物混合液，吹打混匀后5 min内用活体成像仪或多功能读板机检测荧光值。细胞毒性（%）=（空白组荧光值-实验组荧光值）/空白组荧光值×100%。

3.LDH释放法

将细胞的密度调整为1×10⁵个/mL，取100μL加入96孔培养板中，向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质（药物、化学试剂等待检测物质），定容至200μL；细胞自然释放孔加细胞和培养液各100μL，细胞最大释放孔加细胞和2.5% TritonX-100各100μL，放入培养箱中4 h。然后将96孔培养板以250 g离心5 min，每孔吸取上清100μL置于平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应5 min，每孔加入30μL HCl（1 mol/L），在酶标仪490 nm处测定吸光度值。按下式计算细胞毒活性。细胞毒性（%）=［反应孔OD（490 nm）-自然释放孔OD（490 nm）/最大释放孔OD（490 nm）-自然释放孔OD（490 nm）］× 100%。

4.CKK-8检测法

制备细胞悬液，计数。在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μL，同样的样本可做3个重复。将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO2），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质（药物、化学试剂等待检测物质）。将培养板放入培养箱中孵育一段时间，例如6、12、24、48h，具体时间要看待测物质的性质和细胞的敏感性。向每孔中加入10μL CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10% CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。

细胞活力（%）=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100

A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值

A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值

A（空白）：没有细胞的孔的OD值

5.MTT检测法

（1）0.5%的胰酶消化对数期细胞，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10×10⁴个/ml，药物毒性实验一般每孔细胞数量5000—10000个（具体数目根据预实验判断）。

（2）将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入90μL细胞悬液, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加5个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

（3）5%CO2，37℃培养箱继续培养，待细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物。

（4）按照药物作用时间点，每24 h取出一块96孔板检测：

a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h；

b) 小心吸去孔内培养液（用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液）；

c) 每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育10～20 min，这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解）；

d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长490nm的吸光值；

（5）MTT结果分析

6.细胞毒性检测方法的比较

主要参考文献：

1.徐大来, 司远, 田蕾, 等. 免疫效应细胞增殖与细胞毒性功能检测 3 种方法的比较[J]. 南京医科大学学报 (自然科学版), 2021 (3): 355-360.

2.Terrén I, Mikelez I, Odriozola I, et al. Implication of interleukin-12/15/18 and ruxolitinib in the phenotype, proliferation, and polyfunctionality of human cytokine-preactivated natural killer cells. Frontiers in immunology, 2018, 9: 737.

3.Terrén I, Orrantia A, Vitalle J, et al. CFSE dilution to study human T and NK cell proliferation in vitro.Methods in Enzymology. Academic Press, 2020, 631: 239-255.