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细胞培养板如何选择?怎么绘制?内含使用培养板时常见问题解答

细胞培养板因为能给细胞实验节约时间,节约试剂材料费用,可以同时设立多个动态变量方便观察检测等,是细胞培养实验中常用和重要的耗材。但是,你能根据自身需求选择正确的培养板么?你会正确使用培养板吗?对如何处理培养板是否也有困惑?


细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底(U型和V型);培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等;根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。



平底和圆底(U型和V型)培养板的区别和选择

1)贴壁细胞一般用平底培养板;

2)悬浮型细胞的培养一般用V型;

3)U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞 ;

4)V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。


不同形状的板子自然有不同用途

平底的什么类型的细胞都可用,但当细胞数目较少,如做克隆时,就用96孔平底板。


另外﹐做MTT等实验时﹐无论贴壁和悬浮细胞﹐一般均用平底板


至于U或V型板﹐一般在某些特殊要求时才使用。如在免疫学方面﹐当做两种不同淋巴细胞混合培养时﹐需要二者相互接触以刺激。因此﹐一般需要U型板﹐因细胞会由于重力的作用而聚集在一个很小的范围內,V型板的用途更少﹐一般用于细胞杀伤实验时﹐为了使效靶细胞紧密接触﹐常使用V型板﹐但这种实验也可用U型板替代(加入细胞后﹐低速离心)。


如果是养细胞的话, 通常是运用平底的, 另外要特別注意材质, 标示"Tissue Culture (TC) Treated"就是养细胞用的。


圆底的通常是拿来做分析, 化学反应, 或是保存样品用。因为圆底比较好将液体吸得干净, 如果用平底的就不好吸了。不过, 如果你是要测吸光值的话, 一定要买平底的才行。


大部分细胞培养都用平底培养板,便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致,还便于MTT检测。


圆底培养板主要用于同位素掺入的实验,需要用细胞收集仪收集细胞的培养,如“混合淋巴细胞培养”等。


孔数的选择

流式一般用 6 孔,MTT 一般用 96 孔,细胞爬片一般用 24 孔等,要具体根据你的实验来定。


Terasaki 板和普通细胞培养板的区别

Terasaki plate 主要是用于晶体学研究,产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有 sitting 和 handing drop 两种方法。两种方法应用产品的外形结构也不同,材料上选择 crystal class polymer,特殊的材料有利观察晶体结构。


细胞培养板主要材料是 treated sufface,便于细胞贴壁生长与伸展。当然还与浮游细胞的生长材料,降低结合表面积有关,取决于实验材料上的应用与对材料的选择。


细胞培养板与酶标板的区别

用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以,可以用它来做样品的蛋白定量和 MTT 检测。


区别:酶标板一般要比细胞培养板贵,细胞板主要做细胞培养,但也可以用来测蛋白浓度;酶标板包括包被板和反应板,一般不能用做细胞培养,它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测,它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。


常用培养板的孔底面积及推荐加液量

不同孔板所加培养液的液面都不宜太深,一般在 2-3 mm 范围,结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体(氧气)交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。

附培养皿面积:


培养器皿面积(cm2培养液量(ml)细胞量
96 孔培养板0.320.1

105

24 孔培养板21.05×105
12 孔培养板4.52.0106
6 孔培养板9.62.52.5×106
3.5 cm 培养皿83.02×106
cm 培养皿215.05.2×106
10 cm 培养皿5510.013.7×106
25 cm2 培养瓶255.0

5×106

75 cm2 培养瓶7515~302×107


使用培养板时常见问题解答

1、96,24孔培养板或培养皿的盖子都很松,这样是方便了透气,但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢?

答:(1)盖子很松,属于半开放培养,这样的目的是透气(实际上是为了使培养皿外的co2能够与培养皿充分交换,维持培养基的pH值)。

(2)有利必有弊,这样增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发,这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的:

a培养箱内空气必须清洁(定期紫外线照,酒精擦洗,尽量少开关培养箱)

b培养箱内的湿度必须始终保持为100%(培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽)。注意无菌操作!


2、我的细胞接种培养板,细胞总是聚集在周边部分,该如何处理啊?我看有的战友的细胞却是聚集在中间,是不是板子的质量问题?

答:请问你的细胞是如何混匀的?是滴管吹打还是振荡培养板?如果是后者,而且是转圈摇匀的话,很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分,导致细胞中间少,四周多!自己可以试试!


一个好办法:在你培养种板之前,把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出,种入细胞时力量要轻,可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中,培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡,否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。


3、我的细胞传代很正常,但一种到六孔板里(不管加药和对照),总有两三个孔(随机)细胞长得不好,很小,像破碎了。有人遇到过这种情况吗?到底是啥原因呢?

答:可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液,培养基也是从4度冰箱拿出来不久,很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。


另外,跟你细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。


或者放在37度水浴锅里孵育也可以,或者是培养板本身的问题,你再换换其它培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了,种板时的血清浓度调高试一下。


4、最近几天,我用六孔培养板接种细胞,培养24小时后更换培养基,在更换培养基之前,显微镜观察到细胞贴壁,状态非常的好,更换了培养基后,立即用显微镜观察,发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小,产生大量的碎片,而另一半的细胞一切正常,异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭,上半个圆是好的,下半个圆就不好,这是怎么一回事?

答:你可以看一下是不是以下这几个原因

a、培养板没放水平;

b、你的培养液如何,如果培养液过期,细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试

c、可能是板的问题,换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。

d、换培养基的时候有没有注意风机的影响,特别是所需换液的培养板很多时,容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此,换液时应该逐个培养板进行,别怕浪费吸管,注意操作的效率!


5、把细胞消化接种到24孔板之后,已经四天了,老是每孔的中间部分长不满,每天换液时都用PBS 清洗,第二天换液时都出现同样的情况,每孔的边缘长的很好,中央大量死细胞?

答:如果细胞周围密而中间稀疏,大约有如下原因:

  • 培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。

  • 培养箱底部的水是否少了;

  • 细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。

细胞分布均匀与否有一点很关键,即每种细胞是有个体差异的,别人的细胞操作不一定适合于你。所以要靠自己摸索,且找出专属于自己细胞的一套规律,有如下经验:

(1)所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。

(2)按资料记载,24孔板的液体量为1ml,其实1ml的量足矣。

(3)接种时,要慢慢加样,且记得轻微旋转枪头,加样不能太快,避免细胞在一个加样处聚集,且注意在不同的部位进行加样,即边加边活动枪头,人为使细胞趋于均匀分布。这样做对细胞均匀分布有一定效果。


用酶标板检测冠状病毒IgM/IgG的操作步骤

1.加样品:将标本稀释液100ul(或2滴)加到包被板内(预留阴阳性及空白对照2-5孔),将待检血清用PBS或生理盐水按1:20稀释后取10ul加入反应孔内。

2.加对照:加入阴性对照1-3孔,阳性对照1孔,各100ul对照血清。空白对照1孔空置。 

3.温育:将反应板震荡使样品混匀后,置37℃温箱或水浴反应20分钟。

4.洗板:用蒸馏水将浓缩洗涤液15ml稀释至300ml。(1)手洗:将反应板孔内容物倾出,将洗涤液注满反应孔,放置30秒钟后用力甩去,如此重复5次后拍干。(2)机洗:5次,每孔注入洗涤液200ul或注满,停留30秒钟后吸尽拍干。

5.加酶标工作液:每孔加入100ul(或2滴)酶标工作液,置37℃温箱反应20分钟后,洗板5次,洗板操作同步骤4。

6.显色和终止反应:将底物A、B液各50ul(或1滴)加到反应孔内,37℃避光显色10分钟。每孔加入终止液50ul(或1滴)混匀终止反应。 

结果分析:

1.酶标仪设定波长450nm,先用空白调零,然后测定各孔OD值;如果选用双波长测定,不必设置空白对照孔。 

2.当阴性对照平均OD值小于0.08,阳性对照(pc)OD值大于0.30时,说明试剂盒有效且实验操作正确,否则应当重复试验。 

3.临界值(CUT—OFF VALUE)=0.15+阴性对照平均(NC)OD值(当阴性平均OD值小于0.05时,按0.05计算;当阴性平均OD值大于或等于等于0.05时按实际值计算)。 

4.标本OD值≤临界值为阴性,标本OD值>临界值为阳性。 


如何用PPT三步绘制细胞培养板

1、利用曲线工具绘制两个透视矩形,如果不会画,去找张培养板的图片,描一下轮廓即可,将其中一个矩形略微缩小,剪除一个角,在小矩形里面绘制6个椭圆;

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2、把椭圆组合成一个图层,总共三个图层,且把线条颜色改成第5个灰色,1磅大小;

640.jpg

3、按照如下三维参数设置各个图层,上面两个图层深度为150磅,最下面的图层为80磅,且第二和第三个图层的曲面为第2个灰色、1磅;注意的是,三个图层使用的材料为半透明粉,光源为三点,角度为140°

0 (1).jpg

4、调整三个图层位置,使之形成一个细胞培养板,在此过程中,可能需要右键-编辑顶点,拖动顶点位置,使得三个图层的透视关系更符合实际情况

0 (3).jpg

5、绘制培养板里面的溶液:先根据每个空所产生的白色空白区域(下图箭头所示部分)用曲线工具描出形状,然后红色色填充、红色1磅实线,设置深度为150磅、光源设置为发光(0°),材料和旋转角度和前面图形相同;

0 (5).jpg

6、6个孔都绘制上溶液,最终效果图如下。

0 (4).jpg


综合来源于:临床科研那些事,汇科科研助手,张老湿科研作图,CellMax胎牛血清 


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