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「心肌缺血再灌注动物模型」制备方法总结

心肌缺血(myocardial ischemia)是指心脏血液灌注减少,导致心脏供氧减少,心肌能量代谢不正常,不能支持心脏正常工作的一种病理状态。冠心病是临床常见的缺血性心脏病,是指冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞,导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病。


及时、有效地恢复缺血心肌细胞的再灌注是治疗心肌缺血的根本措施。然而,心肌缺血再灌注本身也会引起缺血心肌新的损伤,诱发一系列明显的组织损伤和无菌性炎症反应(即缺血再灌注损伤),影响患者预后。


因此,研究如何降低再灌注带来的心肌损伤也是一项重要的研究工作,具有重要的临床意义,而建立理想的动物模型是研究的前提条件。


心肌缺血再灌注:顾名思义,使心肌短暂缺血后再恢复供血的一种方式。通过手术方式,以结扎心脏冠状动脉,在一定时间后松结,然后对心肌细胞造成二次损伤。


常用的心肌缺血再灌注损伤动物模型建模动物有大鼠、小鼠、兔、猪等。


和其他动物相比,大鼠在进化上与人类比较接近,因其冠状动脉的侧支循环较少,且制作大鼠模型的费用较低,所以大鼠就成为建立心肌缺血再灌注模型的首选动物结扎大鼠的左冠状动脉前降支导致心肌缺血、坏死是目前国内外公认的模型制备方法。




常见造模方法


1)心脏原位结扎法


其优点是心脏处于正常解剖位置,对心脏的生理功能影响较小,但需剪断肋骨,耗时长,结扎冠状动脉时难把握进针位置及深度,操作困难。


2)提线法


提线法包括推管法和压管法。



推管法:将线穿过硬塑管,穿出后轻提两边线头,向下推动该硬塑管,用力压紧线去阻断冠状动脉的血流,一定时间后放松丝线引起再灌注。


压管法:先将线穿过中央有圆孔的软垫,再将线和软垫穿过硬塑管,推动硬塑管时连同小软垫一块压向冠状动脉,实现冠状动脉血流的阻断,放松丝线和软垫则造成再灌注。



提线法的优点是操作方法简单,手术耗时短,但心脏跳动可能会使管的位置发生改变,不能保证实验过程中维持恒定的缺血效果,管切面接触心脏表面,可能造成机械损伤。


3) 胸腔外结扎法


麻醉开胸后,将心脏挤出,充分暴露心脏及其表面的血管,结扎冠状动脉前降支,其优点是心脏被拉到胸腔外,视野好,更容易进行手术操作,但心脏生理功能会受到一定影响,且容易造成动物死亡。




小鼠造模


实验动物:C57BL/6J小鼠,雄性,6-8周,22g±2g,SPF级


实验操作



动物深度麻醉,确认麻醉状态后,将动物仰卧固定于解剖板上,确认动物已无痛觉后,安装好心电监护仪。


剃除动物左胸侧被毛,酒精棉球擦拭剃毛处消毒。剪开心脏搏动最强烈处皮肤(在胸骨左侧第3、4肋间沿胸大肌边缘做一长1cm左右切口),钝性扩张皮肤,暴露肌肉层,穿破胸间肌并扩张肋骨,快速挤出心脏


于左心耳下1-2mm处找到冠状动脉左前降支(LAD),选用6-0丝线,结扎LAD,进针深度约1mm,宽度1-2mm,避免穿透心脏。结扎线打成活结,近针端剪短,远针端线头留3-4cm于胸腔外。


结扎后可见结扎处以下心室壁变成暗红色,将心脏缓慢推入胸腔内。挤出胸腔内气体(防止气胸),胸壁切口作一荷包结打紧,关上胸腔,将结扎线头留于胸外用于冠脉再通。结扎后5min内密切观察心电图改变。


到达缺血时间以后,缓慢拉出结扎线,恢复心肌血流供应,记录心电图数据。


处死前对实验动物采血,进行心肌组织取样、TTC-Evans blue染色,心梗面积计算。



特点:


1、不使用呼吸机,不存在因气管切开而引起的窒息死亡。不需要开胸、插管和拔管,节省了手术时间,效率大大提升,小鼠成活率高。


2、心脏显露时间短,最大程度地减少了手术所造成的损伤,有助于小鼠术后的恢复,能够减少手术过程对后续实验造成的影响。


注意:


①结扎部位的选择。小鼠的左前降支冠状动脉肉眼不可见,所以结扎时在一定意义上属于盲扎,需要一定的经验。


②手术结扎送回心脏后一定要排气,这个严重影响着动物的存活率,所以说这个至关重要。


③做心肌缺血再灌注时,结扎一定要打活结,活线一定要留在胸腔外,当要拉线的时候一定要轻,否则实验也极易失败。




大鼠造模


选择状态较好的SPF级SD大鼠,雄性,8-10周龄,220-250g


实验操作



术前禁食12h,麻醉前1h禁水。大鼠称重后,按50mg/Kg给予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,麻醉成功后,仰卧位固定于手术台。用针状电极插入左下肢连续监测标准Ⅱ导联心电图。用白炽灯照射保暖。


将大鼠颈部剃毛消毒后横行切开皮肤约1cm,并逐层分离暴露气管,于正中第3、4气管软骨环间作一倒“T”型切口,置入特制气管导管,接呼吸机,用缝针固定气管导管。


胸骨左侧剃毛,剃毛处擦碘伏消毒。于胸骨左侧3-4肋间(可手按胸腔感知心脏跳动最明显位置)行横切口切开皮肤(此处有静脉,用止血钳夹下即可不出血),用止血钳钝性分离各肌层,暴露出胸膜,用镊子撕开胸膜进入胸腔。再用两把止血钳横行夹住胸骨,在两钳之间剪断胸骨,插入牵拉器撑开肋骨,剪开心包膜,暴露心脏。


找到左心耳与肺动脉圆锥之间的冠状动脉前降支,在左心耳下离根部约2-3mm,用6-0缝合线绕过动脉深面,在肺动脉圆锥旁沟出针,深约1mm,宽约2mm。把丝线两端从一直径2mm聚乙烯(PE)管中间穿出备用。


稳定10min后,把一棉签棒插入PE管,拉紧丝线用棉签棒将PE管向前推直至阻断冠状动脉血流。再灌注时将棉签棒从PE管中拔出即可。



①大鼠心肌缺血同小鼠的唯一区别就是,小鼠可以凭借挤压胸部的力量使心脏蹦出,而大鼠需要借助止血钳夹取心脏的力量和挤压胸部的力量同时发力来完成,并且夹取大鼠心脏时切不可用蛮力,那样很容易致使心脏破裂,而导致实验失败。这个需要一定的联系来掌握适当的力度和技巧来完成。


②大鼠心脏较大,左前降支冠状动脉肉眼可见,这是相对于小鼠来说独有的优点。




小型猪造模


20kg左右的龄巴马小型猪,性别不限。


实验操作



所有动物术前禁食12h。术前30min,3%戊巴比妥钠20-30mg/kg耳缘静脉麻醉后,将猪仰卧固定在手术台上施行手术。监测心电及血压,据肢体运动情况每20-30min重复静脉注射戊巴比妥钠2-5 mg/kg,使猪保持麻醉状态。


多体位造影评估小型猪的冠脉分布情况,记录相关图像。根据前降支直径选择合适大小的球囊,将球囊导管送至左前降支冠状动脉(LAD)的中远1/3处,球囊充气,腔中持续封堵60min,后撤除球囊完成再灌注。



特点:


该模型因为不开胸,因此可以全模拟PCI病人术后缺损再灌注损伤的过程。由于建模未开胸,因此不会有二次开胸黏连带来的干扰。(注:PCI是经皮冠状动脉介入治疗的简称。




模型验证


1、肉眼观察:左前降支结扎以下心脏颜色变苍白,再灌注后心肌颜色恢复。


2、心电图


心肌缺血成功标志:心电图表现ST段抬高和(或)T波高尖或倒置呈弓背向上抬高,各种心律失常。


再灌注成功标志:再灌注后,抬高的ST段下降>50%,或高尖的T波下降。且再灌注初起时虽出现心律失常、室速、室颤等情况,但之后心率异常逐渐消失,心率逐渐趋于平稳且维持数小时,提示心肌再灌注模型成功。



3、TTC和Evans blue双染观察


梗死的心肌组织呈白色,不能被伊文思蓝和TTC染色;危险区呈红色,被TTC染色,不能被伊文思蓝染色,代表缺血但是还活着的心肌组织,可作为缺血再灌注损伤指标;远端区呈蓝色,被伊文思蓝和TTC同时染色,代表正常心肌组织。


4、血生化检查:外周血中LDH(乳酸脱氢酶),CKMB(肌酸激酶同工酶)的含量测定。


参考来源:

  1. 心肌缺血再灌注损伤模型建立方法的研究进展,白玉花,2015

2. 一种快速建立小鼠心肌缺血再灌注模型的方法,臧光耀等,2019

3. 大鼠在体心肌缺血再灌注模型的建立,汪梦霞等,2013


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