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有图有分析,教你如何进行贴壁细胞的克隆形成实验

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概要



用不同浓度梯度的实验试剂处理细胞24h,经过胰蛋白酶消化后,以低细胞密度接种并温育1~3周,染色后计数集落。



1

材料


无菌

*生长培养基

*D-PBSA

*0.25%粗制胰蛋白酶

*待测定的化合物配成最大使用浓度的10倍,溶于无血清培养基中,检测溶液的pH和渗透压,必要时予以调整

*培养瓶,25cm2

*培养皿,6cm或9cm,在皿底标记


非无菌

*D-PBSA

*甲醇

*1%结晶紫

*血细胞计数板或细胞计数器



克隆形成实验


2


操作步骤


1、准备一系列在25cm2培养瓶中培养的细胞,6组试剂浓度,每组各3瓶,另有3组作对照。每个培养瓶中接种4.5mL细胞悬液(细胞密度为每毫升培养基5×104个细胞),温育48h,胞将进入对数生长期。

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图1单层细胞克隆形成实验。细胞以胰蛋白酶消化、计数、稀释后做单层克隆实验:和贴瓶率测试。受试物可于胰蛋白酶消化前或克隆化接种后加入。当集落生长到可用肉眼观察到但并未重叠生长时,将其固定并染色


2. 准备一系列待测物质的稀释液,每组2mL,为所需终浓度的10倍。

(a)若是首次测定的化合物,在3~5个对数生长范围内采用5倍稀释。

(b)若能预测大致的毒性浓度,可以选择一个较窄的计算范围,每组相隔10或20个数量级。

 

3.在每组浓度的3个培养瓶中各加入0.5mL10倍浓度的待测化合物,从对照组(不含待测物质,但含有用于毒性测定的溶剂)开始,然后从最低浓度向最高浓度进行。

 

4.将培养瓶放回孵育箱。

 

5.若化合物作用缓慢或部分可逆,重复步骤3两次,即将细胞暴露在试剂中3天,每日更换培养基及化合物使其得以更新。若化合物作用快速,暴露1h就足够。

 

6.依次将每组3瓶中的培养基弃去(从对照组开始,由最低浓度向最高浓度进行),用胰蛋白酶消化细胞并计数。

 

7.将细胞稀释至克隆生长所需的密度并接种于培养皿中,稀释细胞,数量与对照组相同。从最高浓度的培养瓶至最低浓度组,最后稀释对照组。

 

8.温育细胞至集落形成(通常需要1~3周)。

 

9.用无水乙醇固定细胞,1%结晶紫染色10min。

 

10.用自来水清洗培养皿、吸去水分并倒置干燥。

 

11.对超过50个细胞的集落(多于5个世代)进行计数。


存活曲线的分析


(1)计算每组药物浓度下的细胞贴壁效率。

(2)计算相对贴壁效率:每组浓度的贴壁率/对照组的贴壁率,即细胞存活分数。

(3)根据所用的浓度范围,在对数或线性浓度下,绘制细胞存活分数的对数曲线(图1)。

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图1存活曲线。细胞存活分数(实验细胞形成的集落对照细胞形成的集落)对细胞毒素浓度的半对数曲线图。典型的曲线有一个“膝部”,IC90位于曲线的线性部分,而IC50位于膝部,其值不太稳定


(4)确定IC50或IC90,其分别是50%或90%的集落形成被抑制时的化合物浓度。由于是半对数曲线图,IC90更为适合,因为其更可能落在曲线的线性部分;而IC50通常落在曲线的弯曲部分,稳定性比较差。

(5)曲线的敏感性差异分析

   (a)曲线的斜率和弯曲部分的长度。曲线的斜率较浅和(或)弯曲部分较长代表敏感性降低;斜率较陡和(或)弯曲部分较短代表敏感性增加。弯曲部分的长度及曲线斜率对IC50 和IC90均有影响,而在IC90可以观察到更为显著的差异(图2)。

   (b)抵抗分数。细胞抵抗分数是指曲线下端的平坦部分。

   (c)抵抗总数。缺乏曲线梯度代表所有细胞均有抵抗。

   (d)曲线下面积。可以通过计算曲线下面积对复杂的生存曲线进行比较,但这样比较只是为了方便,并无数学根据。


 


存活实验测定的参数,有9个基本参数。


(1)试剂的浓度。初次实验应采用以对数增长的较宽的浓度范围(如1μmol/L~1mmol/L,对照):接下来的实验可以根据首次实验结果采用较窄的浓度范围(对数或线性)。

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图2存活曲线的解释。存活细胞对细胞毒素浓度的半对数曲线图。曲线斜率随敏感性的增加而增加,随其降低而降低;当具有完全抵抗时,整个曲线变平坦。部分有抵抗可用抵抗分数表示,表现为曲线低端的平坦处


(2)不变的试剂浓度。某些实验条件不易改变,如培养基、水或不溶性塑料制品的质量。在这些情况下可以改变血清的浓度,因为血清对较小的毒性效应可能有屏蔽作用,此效应可能仅在限制血清的实验中才能显示出来。

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图3培养条件对细胞存活的影响。(a)细胞密度:用不同浓度的5-氟尿嘧啶处理人胶质瘤细胞,然后将它们分别接种于饲养层(虚线)和非饲养层(实线)上。有饲养层时,10-4mmol/L药物作用后,10%的抵抗分数很明显。没有饲养层时,构成抵抗分数的少量集落不能单独存活;

(b)培养基的成分:含高血清的培养基(HSM,实线与方块)与不含血清的培养基(虚线和圆圈)相比,血清可以使IC50升高5倍;去除半胱氨酸可以使IC50降低10倍


(3)暴露在试剂中的持续时间。有些试剂起作用很快,而另一些则慢得多。例如,暴露于离子辐射时,仅需几分钟即可达到所需剂量;而要测试某些周期依赖的抗代谢药物,则可能需要数日才能达到可测量的效应。虽然C×T并不总是常数,但暴露的持续时间(T)与药物浓度(C)依然相关。每日换药可以延长暴露时间从而增加敏感性,其比C×T的预计值高,这是由细胞周期效应与累积损伤所致。


(4)试剂的添加时间。如果试剂是可溶的且估计具有毒性,应依照上篇方案进行。如果试剂的性质未明,且估计有刺激性或仅有微小效应,则试剂可在克隆生长过程中加入,而不必进行预孵育。我们需要进行很谨慎的实验来确定预期毒性,即在克隆胰蛋白酶消化前的培养中使用与体内相当的最少药物。还需要更严格的实验来确定药物不具毒性,在克隆接种及生长期间要延长暴露时间。毒性药物应每周更换,每日换药会降低克隆效率。


(5)暴露期间的细胞密度。暴露在试剂中的细胞密度可以改变细胞与试剂的反应,如HeLa细胞在高密度时对烷化剂甲基氮芥不敏感。


(6)克隆期间的细胞密度。集落的数目在毒性试剂浓度高的时候会降低,但接种更多细胞可能会弥补这种效应,因此每种药物浓度下形成的集落数目可以基本相同。此步骤可以消除低密度克隆对细胞存活的威胁,并提高统计学方面的可信度。但也容易产生误差,因为较高浓度药物作用下的细胞需要以较高密度接种,而这也可能是影响细胞存活的因素。还有一种方法更为可取,将细胞以5×103个/cm2的密度接种在预先形成的饲养层上,此密度远远超过了克隆细胞的密度从而保证了细胞密度的一致性,因为其对总的细胞密度几乎没有影响,所以无需考虑克隆的存活。需要注意的是,饲养层的克隆有时可以显示部分有抗性的细胞,而在非饲养层则并不明显(图3a)


(7)培养基的成分效应。细胞对毒性的反应也受培养基成分影响,因为不同的培养基有不同的增殖效应,而且不同的成分对于毒素的稳定、结合和代谢均有影响。例如,血清可以降低甲醛对口腔上皮细胞毒性的5倍,而半胱氨酸可以降低10倍(图3b)。血清蛋白可以与毒素结合,使其无法影响细胞生长;半胱氨酸和其他巯基可以与细胞内和培养基中的活性化合物结合,从而起到解毒的作用。半胱氨酸可以发生自氧化,培养基的使用期限会因此发生变化。


(8)集落大小。一些试剂可以抑制细胞生长,但是没有细胞毒性,当持续暴露于这些试剂中时,集落的体积会变小,但数目不会减少。在这种情况下,可以应用密度计量法、自动集落计数或肉眼计数每个集落的细胞数来确定集落的体积。进行集落计数时,每个集落细胞数的阈值是完全主观的,通常假定大多数集落的细胞数都远超过阈值。当集落生长到相当大时(>1×103),其生长速度会减慢,而那些仍然存活的较小集落的生长速度则会超过这些较大的集落。若要测定集落大小,可以在较大集落的生长速度减缓之前对培养物进行染色,然后计数所有的集落。


(9)溶剂。某些待测试剂在水性溶剂中溶解度很低,必须用有机溶剂使其溶解。常用的有机溶剂有乙醇、丙二醇、二甲基亚砜,但这些溶剂本身可能对细胞有毒性,因此在配制溶液时应当用最低浓度的溶剂。例如,待测试剂以高浓度溶于100%乙醇中,然后用BBS逐渐稀释,使培养基中溶剂的终浓度<0.5%,还应包括溶剂的对照。


对于有机溶剂应谨慎使用塑料或橡胶制品。未经稀释的有机溶剂最好用玻璃器材,当溶剂浓度<10%时再使用塑料制品。


虽然计算贴壁效率是测定细胞存活率的最好方法之一,但要切记的是,贴壁效率只适用于细胞群体中有克隆形成能力的那些细胞,它不能代表整个细胞群体。如果对照组的多半贴壁效率是100%当然不会出现问题,然而,实际上对照组的贴壁效率多半为20%或更低,所以所测定的反应只是整个细胞群体中的一个部分的状态。



end


来源于《Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications

R.lan Freshney  著


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