用不同浓度梯度的实验试剂处理细胞24h,经过胰蛋白酶消化后,以低细胞密度接种并温育1~3周,染色后计数集落。 1 材料 无菌 *生长培养基 *D-PBSA *0.25%粗制胰蛋白酶 *待测定的化合物配成最大使用浓度的10倍,溶于无血清培养基中,检测溶液的pH和渗透压,必要时予以调整 *培养瓶,25cm2 *培养皿,6cm或9cm,在皿底标记 非无菌 *D-PBSA *甲醇 *1%结晶紫 *血细胞计数板或细胞计数器 2 操作步骤 1、准备一系列在25cm2培养瓶中培养的细胞,6组试剂浓度,每组各3瓶,另有3组作对照。每个培养瓶中接种4.5mL细胞悬液(细胞密度为每毫升培养基5×104个细胞),温育48h,胞将进入对数生长期。 图1单层细胞克隆形成实验。细胞以胰蛋白酶消化、计数、稀释后做单层克隆实验:和贴瓶率测试。受试物可于胰蛋白酶消化前或克隆化接种后加入。当集落生长到可用肉眼观察到但并未重叠生长时,将其固定并染色 2. 准备一系列待测物质的稀释液,每组2mL,为所需终浓度的10倍。 (a)若是首次测定的化合物,在3~5个对数生长范围内采用5倍稀释。 (b)若能预测大致的毒性浓度,可以选择一个较窄的计算范围,每组相隔10或20个数量级。 3.在每组浓度的3个培养瓶中各加入0.5mL10倍浓度的待测化合物,从对照组(不含待测物质,但含有用于毒性测定的溶剂)开始,然后从最低浓度向最高浓度进行。 4.将培养瓶放回孵育箱。 5.若化合物作用缓慢或部分可逆,重复步骤3两次,即将细胞暴露在试剂中3天,每日更换培养基及化合物使其得以更新。若化合物作用快速,暴露1h就足够。 6.依次将每组3瓶中的培养基弃去(从对照组开始,由最低浓度向最高浓度进行),用胰蛋白酶消化细胞并计数。 7.将细胞稀释至克隆生长所需的密度并接种于培养皿中,稀释细胞,数量与对照组相同。从最高浓度的培养瓶至最低浓度组,最后稀释对照组。 8.温育细胞至集落形成(通常需要1~3周)。 9.用无水乙醇固定细胞,1%结晶紫染色10min。 10.用自来水清洗培养皿、吸去水分并倒置干燥。 11.对超过50个细胞的集落(多于5个世代)进行计数。
来源于《Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications》
R.lan Freshney 著