01► 类器官的传代
1）上下吹打以破碎基底膜提取物（Basement Membrane Extract ，BME），然后将类器官悬浮物转移至 15 mL 锥形管中。 2）为了促进 BME 的去除，从顶部加入 10 mL 冰预冷的 adDMEM/F12+++ 培养基。 3）类器官在 4°C 条件下以 200 g 的转速离心 5 分钟。 吸出上清液，采用 TrypLE 或机械破碎来分解类器官，前者适用于头颈部和紧实的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官，后者适用于卵巢和囊性的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官。
➣ 在采用机械破碎时，将沉淀重悬在 3 mL adDMEM/F12+++ 培养基中。在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和（不带滤芯）P10 吸头，上下吹打类器官悬液 30 次。枪头紧靠管的底部来产生更大压力，有助于类器官的分解。 ➣ 在采用 TrypLE 解离细胞时，将沉淀重悬在 1 mL TrypLE 中，上下吹打并在 37°C 条件下孵育，直至类器官分解。在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和（不带滤芯）P10 吸头，每 3～5 分钟上下吹打 ≥ 10 次，以促进类器官的分解。密切监控消化过程，尽量缩短 TrypLE 的孵育时间。
如上步骤的更优替代方案：基质胶收获液分解法
整个步骤在冰上操作，吸掉培养基并轻轻用 10 倍体积的冷（2～8℃）PBS（96 孔板- 50 μL/孔、48 孔板- 250 μL/孔、24 孔板- 500 μL/孔）来清洗，注意不要吹破包埋了类器官的基质胶。吸去 PBS，加 10 倍体积（同 PBS 用量）的冷（2～8℃）收获液（推荐 R&D Systems®，货号：3700-100-01）到每个孔，在 2～8℃ 的冰上孵育 30～90 分钟并进行温和的振荡，直到基质胶完全消融，类器官漂浮起来。 如果要将类器官细胞团分解，请将溶液吸入无菌注射器，并装上 20 号针头，推动注射器（所使用的力量和速度决定推出的细胞团的大小）。 之后，在冰上将孔板内的含类器官的溶液转移到 15 mL 或 50 mL 的离心管中，在 2～8℃ 条件下以 500 g 的转速离心 5 分钟，去上清。用 10 倍体积的冷（2～8℃）PBS 再次清洗，在 2～8℃ 条件下以 500 g 的转速离心 5 分钟，收集类器官沉淀用于后续操作。 注 ● 使用 TrypLE 解离不要超过 15 分钟，因为这可能导致类器官生长不佳，甚至培养物损失。根据经验，在观察到小块细胞（由 2～10 个细胞组成）的混合物时，消化即已完成。 ● 如果在为药物筛选做准备，则不完全消化产生的大块细胞或完整的类器官碎片将导致类器官产量很低，因为在制备药物筛选的类器官悬液时这些过大的细胞和碎片都会被过滤掉。
5）在消化完成后，用 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基清洗。 6）按照《师弟求着问我要的类器官培养手册，看完直呼太香了！》第 8～11 步所述，将类器官沉淀重悬在 70%（体积比）BME 中，并以小液滴的形式铺在预热的培养板底部。在铺板完成后，翻转培养板并将其置于 37℃、5%（体积比）CO2 加湿培养箱中，孵育 30～60 分钟。 7）将含有 10 μM ROCK 抑制剂的类器官培养基预热至 37℃。 8）在 BME 微滴凝固后（30～60 分钟），向各孔中小心加入预热的培养基。 9）将培养板置于 37℃、5% CO2 加湿培养箱中，直到类器官要用于药物筛选。或者用于后续的冻存和复苏步骤。
图 1：类器官分离培养及应用流程示意图
02► 类器官的冻存
10）在类器官传代 2～3 天后，去除培养基，向各孔中加入 500 μL adDMEM/F12+++ 培养基。利用 P1000 带滤芯吸头来分散 BME 微滴，然后将其转移至冰预冷的 15 mL 锥形管中。
注 为确保在清洗时去除 BME，最多可将 24 孔细胞培养板的 12 个孔合并在 15 mL 锥形管中。如果要用更多的材料，则每次培养时使用多支管，之后在准备类器官用于筛选时合并。
11）（可选）如果存在大量 BME，则在含有类器官的 15 mL 锥形管中加入冰预冷的 adDMEM/F12+++ 培养基，使其总体积为 12 mL，并用预先（用 adDMEM/F12+++）润湿的 10 mL 血清移液管上下吹打，再置于冰上 10 分钟。在此期间用 10 mL 血清移液管吹打数次。将样本在冰上放置更长时间会进一步溶解 BME。 12）类器官在 4°C 条件下以 200 g 的转速离心 5 分钟。 13）吸出上清液，不要扰动沉淀。 14）加入所需体积的细胞冻存培养基（例如商业化冻存试剂或 90% FBS + 10% DMSO），并用 P1000 移液器上下吹打，彻底重悬类器官。
注 24 孔细胞培养板中 4 个「原始」孔培养的类器官，对应使用 500 μL 冻存培养基。
15）在每个无菌的冻存管中加入 500 μL 带有重悬类器官的冻存培养基。 16）将冻存管保存在 -80℃ 冰箱中，24 小时后，取出冻存管，将其转移至液氮罐中（约 -180℃）。
注 冷冻保存的类器官可在液氮罐中保存数年。
03► 冻存类器官的复苏
17）将带有冻存类器官的冻存管从液氮罐转移至干冰上。 18）对于每个要复苏的冻存管，在室温下准备一个装有 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基的 15 mL 锥形管。 19）将冻存管放入 37°C 水浴中，孵育 1～3 分钟。
注 仔细监控解冻情况，并在冻存试剂解冻后立即从水浴中取出冻存管。为了预留走到超净台所需的时间，可以考虑在仍有少量冰块时取出冻存管。
20）在冻存管中逐滴加入 1 mL adDMEM/F12+++ 培养基，同时不断混匀，然后将冻存管中的全部内容物（包括类器官）转移至 15 mL 锥形管中。在锥形管中加入 adDMEM/F12+++ 培养基，使其总体积为 10 mL。 21）类器官在 4°C 条件下以 200 g 转速离心 5 分钟。 22）吸出上清液，不要扰动沉淀。 23）按照前文所述的第 6～9 步操作。
注 根据复苏类器官的（溶液）体积，如果在清洗过程中冻存试剂未能达到至少 10 倍以上的稀释，则应增加额外的清洗步骤，以确保冻存试剂在铺板前得到充分稀释。
如本方案所述，Bio-Techne 可提供实验方案中各类工具，包括细胞因子：如 WNER（分别代表：Wnt-3a、Noggin、EGF 和 R-Spondin 1）；小分子化合物：如 Y-27632、SB 202190、A83-01；BME（3536-005-02、BME001-10），适用于各种类器官的培养，如：肿瘤、肺、肝、结肠、胰腺、乳腺、输卵管等。
图 2：使用 Cultrex RGF BME，Type 2 培养的人肺类器官
