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CCK-8实验最全操作步骤

CCK-8是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的细胞生物学实验。CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成分。细胞增殖越多越快,细胞颜色越深,证明毒性小;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅 (生成的 formazan 量) 和细胞数目呈线性关系



一 实验材料及试剂

细胞,96孔细胞培养板、CO2培养箱、酒精灯、微量移液器、酶标仪、CCK-8试剂盒等。




实验步骤

Protocols


1. 取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液,每孔100ul加入96孔细胞培养板中。通常细胞增殖实验每孔加入2×103个/100ul 细胞,细胞毒性实验每孔加入5×103个细胞/100ul (具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定)。如果是贴壁细胞,需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验,如果是悬浮细胞,不需要预培养。


2. 根据实验需求,在培养孔中加入0-10ul待测样本继续培养适当时间。如果是做细胞毒性试验,加入毒性物质后的培养时间需要摸索。要看毒性物质的性质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要1-2代以上的时间。

3. 取10ul CCK-8溶液加入96孔细胞培养板,在37℃培养箱中继续孵育0.5-4小时。

4. 测定吸光度。建议采用双波长进行测定,检测波长430-490nm,参比波长600-650nm,或者采用450nm单波长检测。

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计算公式
细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ;
Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液,不含药物) ;
Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液,不含细胞、药物) 



注意事项

Attention


1. 如果细胞起始的培养体积为200ul,则需加入20ul的CCK-8溶液,以此类推。
2. 建议每个药物浓度孔设置3个复孔,最后取均值做曲线。
3. 设计好实验对照,尽量排除其它因素的干扰:
1)空白对照:可以用加了等量细胞培养液、CCK-8溶液和药物但没有加细胞的孔;
2)阴性对照:不加药物但加了药物溶剂的细胞孔。
4. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,如果待测物质有氧化性或还原性,可能会干扰检测,需设法去除(加入CCK-8溶液之前更换新鲜培养基,去掉药物影响。如果药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可)。
5. 加入CCK-8溶液后注意孵育时间,孵育时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定,初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6. 细胞在培养箱内培养时,培养板最外边的孔容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作测定孔用。
7. 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10ul 10% SDS溶液终止反应,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会变化太大,一般还是建议立刻检测。
8. 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定。


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