常规qPCR在一个反应管中只检测单一指标，因此如果有多个指标或样本需要检测，无疑是qPCR试剂和样本的巨大浪费。在多重qPCR中，通过单个反应管扩增来检测多个靶。每个靶标由不同(或相同)的一组引物扩增，并且特异性探针区分每个PCR扩增。因此，您可以快速测量几个目标或目标基因的表达水平。这种在单个反应管中同时检测多种指示剂的方法大大减少了相关试剂的用量。也会节省您的样品处理时间和其他试剂耗材。因为在一个管中检测多种目标，所以不可能使用常规的SYBR Green I染料来标记扩增产物。水解探针法是最常用的解决方法，即针对每个指标设计特定的探针，利用不同探针上标记的不同波长的荧光基团来区分每个指标的荧光变化。多重qPCR的实验设计要求比单一反应体系复杂得多。用于检测不同目标的探针必须携带具有不同光谱范围的荧光基团。下图是几种常见荧光基团的发射光谱。从图中可以看出，虽然许多荧光光谱相似的荧光基团的最大发射波长不同，但在附近的波段内，它们仍然会相互重叠。有必要避免荧光基团的发射光谱之间的相互干扰。不同荧光基团的荧光强度有高有低。比如FAM是荧光强度相对较高的一组，所以我们更倾向于将其安排给表达相对较低的靶基因，而荧光强度相对较低的一组可以用来检测表达相对较高的看家基因。这样就达到了放大曲线平台的目的，结果会更漂亮。不同荧光定量PCR仪器的激发光和发射光不同，需要根据相应的仪器选择合适的荧光基团。目前，使用最广泛的荧光基团是FAM(FITC)。因此，FAM是大多数多重qPCR策略的首选渠道。如果使用了不适合仪器的荧光组，必须在此之前针对该荧光组对仪器进行校正。目前主流的荧光定量PCR仪仍然可以支持更多通道的多重检测。在选择了探针的荧光基团后，可以根据荧光基团的类型来匹配猝灭基团。多个QPCR不需要不同的猝灭基团。例如，在两个QPCR中选择FAM和VIC为荧光基团，可以统一选择BHQ-1作为猝灭基团。此外，需要优化多重qPCR的引物探针序列的特异性，以防止它们相互干扰。确定最佳引物探针比等等。一般情况下，建议极限是不超过4个重，超过4个重量会比较困难。打算做很多重的小伙伴请做好准备~
