WB如果恰巧碰到跑出了趋势，但就是背景脏，真的是想撞墙了，所以在整个Western blot的实验中，怎么让自己结果别因背景脏毁了呢？这里要清楚一点，背景脏不一定是因为仪器不干净造成的，也有可能是蛋白降解或者整个实验过程中条件不对造成的。1. 实验准备：提取蛋白所需的研磨器材，以及电泳仪的玻璃板、梳子要清洗干净，若长期不使用，建议玻璃板之间用纸隔开，或者放在置物架上，避免长期放置后，玻璃板黏连在一起。2. 提取蛋白：选择合适的蛋白裂解液，充分去除一些干扰因素，比如核酸，多糖，脂类等；建议蛋白分装在0.2ml的Ep管中，避免反复冻融使某些蛋白发生改变;同时要注意Loading buffer的保质期，每次加完之后要充分混匀，再去煮沸。3. 制胶：玻璃板夹紧之后，我们会习惯性加水试一下是否漏胶，建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水；灌胶之前要将配好的试剂充分混匀，灌胶的过程中要掌握好速度，缓慢加样，避免产生气泡。然后缓缓加入无水乙醇封胶，该步操作时速度一定要慢，防止把胶面冲变形；在等待分离胶凝固的过程中，不要总去摇晃观察，温度较高的情况下，30min左右就会凝固，冬天气温较低可能需要较长时间。分离胶液面不平，也会影响后期蛋白电泳的效果。4. 转膜：转膜前需在一张转膜板两侧各放置3-4张滤纸（两侧数量相同）。切记不要用手直接接触PVDF膜和滤纸，手上的油脂会对其造成污染，同时要佩戴干净的手套，全程尽量使用镊子夹取。同时要赶走每一层之间的气泡。5. 转膜时要使整个机器之余冰水混合物中，转膜时我们常用220V或者其他高电压进行，机器温度升高，会使蛋白降解，也就是我们转膜后，用丽春红染色发现条带跑糊，发光后条带和背景都会脏的一塌糊涂。6. 孵育抗体：我们孵育一抗的时间大多会选择4度过夜，但是具体多长时间算合适，其实没有硬性规定，但是二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育两小时，并要清洗干净，否则显影效果，背景会脏。7. 发光液配置：像大部分实验室使用的ECL发光液，A液和B液按照1：1的比例配置，发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量，发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。
