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皮下荷瘤构建注意事项

肿瘤药物的开发依赖于临床前模型来进行药物作用靶点和机制的探究、给药方式和剂量以及药物安全评估。目前这些临床前模型大多属于皮下荷瘤

       

皮下荷瘤:把肿瘤细胞接种到老鼠的前肢腋下或背部皮下等位置,观察成瘤结果。由于①该模型操作简单方便,可以直观观察肿瘤的生长,方便检测动物体重、肿瘤生长曲线、肿瘤重量等重要数据;②可以对组织和体液样本进行相关分析,广泛应用于肿瘤发病机制研究或者抗肿瘤药物筛选检测等的实验中,成为肿瘤学研究中必不可少的实验动物模型之一。


皮下荷瘤可分为组织块移植的皮下瘤和细胞移植的皮下瘤。由于肿瘤细胞系容易获得,建模成本低,大量关于基因组学,细胞功能学及药效反应数据可供参考,因此细胞移植的皮下瘤应用非常广泛今天,小编重点介绍细胞来源的皮下移植瘤。


❖ 细胞皮下荷瘤关键 ❖


做过细胞皮下荷瘤实验的同学可能都遇到过,同时接种细胞的老鼠长出的皮下瘤大小却差异明显,肿瘤不是过大就是过小,甚至肿瘤串状发生或不成瘤,导致实验结果很差或不能进行。是不是很崩溃?


皮下荷瘤看似简单,然而由于里面诸多的影响因素不被我们所重视,以致于在实验过程中造成不必要的时间和材料的浪费。接下来,小编将和大家分享一些影响皮下荷瘤成功的关键点,供大家参考和讨论。


(一)肿瘤细胞

首先,细胞株的选择是一个极为重要的问题实验用的细胞系多为人源细胞系或鼠源细胞系,人源细胞系更为接近人类肿瘤增殖情况,但却不能在免疫正常的老鼠身上生长。

一般情况下,并非所有的细胞株都具有较好的成瘤性。有时同一类型的肿瘤不同的细胞系成瘤效果却不一样。比如同为金黄仓鼠胰腺癌细胞系HPD-1NR皮下成瘤率很高但HCPC1细胞皮下接种成瘤效果却很差。


另外,有许多细胞株基本都是从体外开始进行研究,我们需充分考虑细胞株在动物体内的生长情况,例如A549和MCF-7,其在体内并不是一个好的研究对象,其成瘤率低,生长缓慢,且均一性较差。


而有些肿瘤细胞株本身对药物的敏感性,例如Lovo细胞,体内生长情况比较理想,但是对于药物的敏感性比较差,大部分的常规化疗药对其的抑瘤率都会下降。


结合自身实验目的选择肿瘤细胞系,尽量选择成瘤率高的细胞系!


其次,肿瘤细胞活力、生长期及有无污染等对成瘤影响非常大。接种细胞一般要选择生长状态良好,无病毒、细菌或支原体等污染,处于对数生长期的细胞。


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细胞的接种量直接关系肿瘤的成瘤效果。接种细胞数量过少可能在老鼠皮下不能成瘤或成瘤后生长极慢,但接种量过多则可引起肿瘤疯长,这两种情况均不利于实验顺利开展。细胞接种量可以查阅文献确定或者做预实验确认。


皮下荷瘤细胞数量/体积可1-5×106/0.1ml注射点的范围内选择,一般动物源性肿瘤接种2~6×106即可成瘤,而人源性肿瘤细胞则需要107级细胞才能形成相对理想的肿瘤。注射体积100ul或200ul均可,超过200ul可能会漏液。


(二)小鼠的选择

小鼠品系的选择要根据细胞系来源。人源细胞系(异种移植)应该选择免疫缺陷的小鼠(如:nude,NOD/scid,NSG),不过免疫缺陷鼠的免疫系统异常,不适用于筛选免疫调控药物;鼠源细胞系(同种移植)选择与肿瘤细胞系来源一致的小鼠(C57BL/6品系来源的黑色素瘤细胞系B16F10就要选择C57BL/6品系的小鼠)。


肿瘤细胞系移植模型
1
鼠源肿瘤细胞接种同源小鼠
同种移植
2
人源肿瘤细胞接种免疫缺陷小鼠
异种移植


同时选择鼠龄差异小或体重差异小的成年鼠,保证同批实验鼠个体差异小。性别一般雌雄均可,但临床上跟性别相关性大的肿瘤细胞则需要进一步选择老鼠性别,比如乳腺癌细胞选择雌雄,前列腺癌细胞选择雄性。


动物进入动物房后适应性饲养一周左右,待其适应新环境后再进行接种实验。


(三)接种操作

实验员丰富的接种经验极为重要,新手要多多练习接种或邀请接种经验丰富的人员完成接种环节。


1.接种前避免激烈震荡细胞,可用移液枪将细胞悬液轻轻地充分吹散,防止细胞成团而降低细胞成活率。


2.接种部位选择血管丰富且易操作的部位接种,如腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部等部位。其中腋下中后部皮下较好,成瘤率高。


3.接种深度:进针时先用针头刺破皮肤,持平注射器使针头在皮下行进一段距离(约1cm深)后开始注射,注射前针头稍微动一动,能动说明在皮下,否则可能在皮内或者肌肉内。(明确针头在皮下后方可注射,绝不可刺破皮肤或者刺破肌肉层。)接种点离进针点尽量较远,减少漏液和污染的可能。


4.注射过程中不可使针头移行,注射速度不宜太快。注射结束后缓慢旋转拔出注射器,同时用棉签轻压进针孔处以免有细胞液流出。


5.接种环节应由一人完成所有动物接种,避免同一实验多人操作。


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注意:

(1)细胞需一直置于冰上,使细胞处于比较低的代谢状态,一般2h之内不会有问题。


(2)在正式实验研究中,我们建议一只老鼠只能接种一个位点,因为一个裸鼠身上如有多于一个肿瘤,可能会相互影响。


(3)接种肿瘤细胞时,皮肤不用绷得太紧,平展即可。


❖ 举例:裸鼠皮下荷瘤步骤 ❖


研究中广泛使用的是人源肿瘤细胞系异种移植,是将体外传代培养的人源肿瘤细胞接种到免疫缺陷的小鼠上观察肿瘤的生长,用来研究肿瘤细胞增殖或进行体内药物筛选实验的模型。


由于裸鼠的免疫缺陷,在一定情况下,不排斥来自异种动物的组织移植。因此成为移植人类肿瘤的接受体。接下来,为大家详细介绍裸鼠皮下荷瘤步骤:


1、细胞准备

⑴肿瘤细胞的传代扩增


取冻存于液氮的肿瘤细胞复苏并扩增,确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态。首先,从液氮罐里取出冻存的细胞株,进行细胞复苏,复苏后的细胞会渐渐恢复活力、迅速增殖。当贴壁生长的细胞覆盖了培养皿底面的80%以上时,就要进行细胞的传代培养,传代会给细胞提供更多的生长空间和足够的营养物质。


⑵计算细胞接种量


提前计算确定细胞数量,一般注射40只小鼠,至少需要准备50只小鼠的细胞量。


2、裸鼠准备

一般选择5-6周裸鼠(体重18-20g左右),小于4周动物可能不耐受而过早死亡,大于6周免疫力会增强,不易成瘤。同批实验鼠要保证个体差异小。


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3、操作步骤

①当细胞生长到我们需要的数量时,就可以进行收集,胰酶消化收集细胞,计数后并调整到合适的浓度(PBS或者无血清培养基稀释细胞,若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤)。


②接种时选择好部位进针,建议接种前用75%酒精棉球擦拭消毒进针位置。


③针头在皮下走一段再注射,速度不可太快,一般体积为100-200μL,可看见明显的鼓包。


④注射完毕后,缓慢旋转拔出注射器,然后将小鼠放回笼内继续饲养,大概1周后可看到肿瘤出现。一般当小鼠皮下长出约绿豆大小的肿瘤块时,我们便可每隔2-3天进行肿瘤体积的测量,动态反应药物的抗肿瘤效果。根据实验设计时间处死小鼠,取肿瘤,拍照。


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