科研星球

胶回收和PCR产物回收技巧​

1、增加电泳时的上样量。


2、 电泳缓冲液用新鲜配制的。


3、 切胶时尽量只切有条带的胶,减小切胶体积:含目的片断很少的胶就不要要了,不然影响回收率。


4、把切的两块或多块胶融化后,无论多大的体积都用一个管子,转移到同一个柱子上。


5、溶胶时所加的溶液可多一点,这样更有利于DNA与膜的结合,不过一般不要多余750ul。


6、胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合。因此,若电泳缓冲液的PH偏高,可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0,3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子更好的拦截在膜上,可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。


7、加洗脱液之前,将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟),以使乙醇充分挥发。


8、最后少加些洗脱液,尽量减少回收体积,一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少,否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央,以充分洗脱结合在膜上的DNA。


9、 可以在加入洗脱液之后,可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱,或用封口膜密封4度过夜,第二天再离心回收,效果不错。


10、 将离心后的洗脱液加回吸附柱,再次离心。



PCR 产物回收的详细方法和步骤


1、 普通胶回收


如果要胶回收,最好还是用试剂盒,方便,回收率也略高,实在要手工回收,可以切胶后加入3倍体积TE,水浴熔化后,酚、酚/氯仿抽提干净,乙醇沉淀即可。


2、 从低熔点凝胶回收DNA


纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA ),置65℃水浴5分钟保温,使凝胶完全溶解。


待放至室温,加等量酚(TE饱和,TE封在上层,取下层酚),轻轻混匀(不用混匀),12000rpm,3分钟离心。反复1-2次。


取上层液,加0.1体积3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解,测定含量,备用(可用于目的基因结构分析,探针制备等)。


3、 扩增特异性好的PCR回收


如果PCR扩增特异性好,只是简单的PCR产物纯化回收,可以在PCR产物中加入50ug/ml 的蛋白酶K,37度1h,酚/氯仿抽提一次,氯仿抽提一次,上清加入0.1体积的醋酸钠,2.5体积的无水乙醇沉淀回收。


QQ客服
电子邮箱
淘宝官店
没有账号?