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细胞侵袭实验步骤

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实验原理

将细胞小室(Transwell小室)放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

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细胞小室(transwell)


应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同,具体选择时要考虑到细胞大小。


所应有的常见实验

共培养体系:

小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。

将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。


趋化性实验

可用5.0、8.0、12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。


肿瘤细胞迁移实验

常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。


肿瘤细胞侵袭实验

常用8.0、12.0µm膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁移实验不同的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。



侵袭实验操作

实验用品

细胞小室

有很多不同规格,根据实验需求自己选择。


上层培养液

上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入0.05%-0.2% BSA。


细胞

值得注意的是,有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不必要的浪费,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,并不是笔小数目,还是小心为妙。

另外,为了让实验结果更明显,可先撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验。


基质胶:

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,

如果购买的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不需要购买了。


下层培养液:

下层常用含5%-10% FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子,但个人认为,FBS仍是最合适的。


细胞培养板:

常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求,普通的细胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。

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24孔细胞小室

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12孔细胞小室

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6孔细胞小室


此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白,这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原(collagen)或明胶(gelatin)。细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。如果培养时间很长(>24h),细胞还是会掉到下室里面去,所以有条件的话,最好还是在膜下层涂上FN。另外,值得一提的是,膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。


实验步骤

无基质胶Transwell小室制备

① 包被基底膜:

用50mg/L Matrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。

② 水化基底膜:

吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min。

另有方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。


制备细胞悬液

① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。


② 消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。


具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。


对照组和处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。


接种细胞

①取细胞悬液100-200µl加入小室,不同公司的、不同大小的小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200µl。


② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。


③ 培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

另外,我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张,是正常现象。

在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生。


结果统计

检测穿过的细胞数有两种方法:

直接计数法

1、“贴壁”细胞计数

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。可以通过给细胞染色,可在镜下计数细胞

① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞;

② 染色:常用的染色方法有结晶紫染色、台靡蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。

③ 细胞计数:使用正置显微镜进行观察和拍照,把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保存,但是这样做小室就成了一次性的了,未免有点浪费。

取若干个视野计数细胞个数。一般采用3-5个视野,也有人用10个,都是随机选取。


间接计数法

由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上,而是掉进下室。

间接计数法主要用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法,与常用的MTT实验是同样的原理。

1、MTT法

① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞;

② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37℃ 4h后取出。

③ 24孔板中加入500µl DMSO,将小室置于其中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲湃充分溶解。取出小室,24孔板于酶标仪上测OD值。


2、荧光试剂检测

这类方法一般是与Transwell小室一起出售的,其原理与MTT法类似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。


3、结晶紫检测

上文已说过,这里不再赘述,原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点,就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。



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