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裸鼠成瘤实验技巧盘点

裸鼠,又名无胸腺裸鼠。它是先天性胸腺缺陷、由于第VIII连锁群内裸体位点基因发生纯合而形成的突变小鼠。


裸鼠在科学研究中之所以能成为有巨大潜力的试验模型,是由于nu基因有独特的遗传特性。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力,已将nu基因导入不同近交系动物,成为系列动物模型,仅小鼠模型一种,已建立了二十余种近交系裸鼠。


由于它们具有不同的遗传背景和nu基因的遗传特性,使医学生物学研究者获得一种极其宝贵的试验材料。本文将重点介绍裸鼠的成瘤实验方法。


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实验室常见成瘤细胞


常规较容易成瘤的细胞:Hep-G2(肝癌),Hep2(喉癌),NCI-H460(大细胞肺癌), A431(表皮癌),SK-OV-3(卵巢癌),MCF-7(乳腺癌)SKBR3, A375/B16-F10(人黑色素瘤细胞),SGC7901 人胃肿瘤细胞  ,KB人口腔表皮样癌细胞


可以成瘤但是比较慢的细胞:CNE(鼻咽癌),A549(肺癌), SPC-A-1(肺腺癌), HT-29(结肠癌),BEL-7402(肝癌),MDA-MB-231 乳腺癌  , CT26 (小鼠结肠癌细胞 ),SH-SY5Y (人神经母细胞瘤细胞 ) , U251 (人胶质瘤细胞) , BGC-823(人胃癌细胞)  ,PC-3 (人前列腺癌细胞)


一些比较有争议的细胞:Hela(宫颈癌),HCT(人回盲肠癌细胞/人结直肠癌腺癌细胞)。其他:BMSC(骨髓间充质干细胞)


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裸鼠成瘤实验技巧


裸鼠的选择


实验室常用的是BALB/c-nu裸小鼠 ,随着裸小鼠年龄增长或有关因素的影响(如病毒感染),裸鼠体内正常T细胞会增加,故接种肿瘤实验一般采用4--6周龄的裸鼠。



裸鼠成瘤实验技巧


1、细胞的状态是成瘤实验的关键,所以细胞生长状态一定要好,取处于对数生长期的细胞,细胞达80-90%左右密度为宜。收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。


2、胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍,目的为去除细胞中残余的血清。


3、用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度,一般皮下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/支,接种体积为0.1-0.2ml,因此细胞悬液的浓度为1-5×10^7个细胞/ml,如若有条件的实验室,也可以加基质胶以加速瘤块的生成,基质胶与PBS或无血清的比列为1:1。


4、细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下,一般尽量在半小时内完成(如果接种量大,可以分批接种),途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢以保持细胞的活性。


5、选择的裸鼠一般在4-6周龄,体重16-18g左右,种植部位选择血供丰富区域,如腋窝中后部。


6、接种前用枪将细胞悬液充分的吹散,防止细胞成团而降低细胞成活率,并且导致小鼠接种细胞数量的差异过大。


7、接种时,针头在皮下进针深一点,约1cm深,针头在皮下左右滑动几次,以便细胞接种成团,减少注射后细胞悬液从针眼溢出。


8、如何保定裸鼠?左手拇指和食指捏紧裸鼠颈背部皮肤,小拇指夹住裸鼠尾巴。


9、接种后1-2周左右可以见到皮下开始出现肿块。


10、根据肿瘤细胞的特性和接种细胞的量,一般皮下成瘤的周期为1-2个月。肿瘤不宜生长过大,一般不要超过2000mm3。


11、肿瘤大小测量一般为1周两次,游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位。V=1/2*a*b2 (a为长轴,b为短轴)。


12、皮下瘤取下后一部分冻液氮用作以后提蛋白和RNA,一部分福尔马林固定用做免疫组化、免疫荧光等。



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常见问题及解答


1、这个实验为什么用裸鼠而不用普通的老鼠或者小白鼠?


裸鼠成瘤实验用的裸鼠,最大的特点是没有胸腺等免疫器官,它的免疫力几乎为零,对肿瘤细胞没有免疫作用,易于成瘤。


2、瘤块长起来又消失?


肿瘤块先缩小,后变大很常见,很可能是炎症反应,肿瘤细胞被小鼠自身吸收,继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来,长不起来建议换鼠。


3、是否可以在一只小鼠进行多个点接种?


不可以,一只老鼠就只能接种一个点,因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下,可能会相互影响。


4、肿瘤长不出来是怎么回事?


第一:肿瘤生长周期很慢,一周开始生长肿块,大约需要1~2个月才能长成肿瘤;


第二:可能是细胞状态差,活力不好,或是肿瘤细胞不易成瘤,需加入基质胶辅助或增大接种量或更换细胞系;


第三:一方面可能是小鼠周龄太大,或小鼠免疫排斥,建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠(Nod-scid小鼠)。


5、肿瘤体积相差很大,大小不一?


首先,并不是所有的肿瘤都能够长得均一形态。其次,这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致,建议重新接种。


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