科研星球

影响 PCR 体系蒸发的三大因素

提及 PCR 实验,是否出现过这样的问题?

假阳性

非特异性扩增

数据重复性差

假阴性

拖尾

无扩增产物

样本降解


其实,造成这些结果的原因有很多,例如引物质量不佳、模板质量不好、退火温度不合适等,但还有一个不容忽视的问题——PCR 体系蒸发。


聚合酶链式反应(PCR)需要依赖 PCR 仪对各反应阶段的温度和加热时长进行控制,整个 PCR 反应通常需要经过 20~40 次加热、冷却的温度循环,这个过程带来的反应如试剂蒸发和损失,对许多 PCR 实验结果影响显著,在检测灵敏度高的 qPCR 实验中还影响透光性,从而导致结果不准确。


那么,影响 PCR 体系蒸发的因素都有哪些呢?



1、热盖压力、温度


为了防止 PCR 高温反应中试剂向上挥发,PCR 仪一般通过在试液孔板上方覆盖热盖单元,以上方高温来减少试剂的挥发。但热盖能完美解决蒸发问题吗?


PCR 仪的热盖大致可以分为以下四种:非可调式热盖、可调节式热盖、自适应式热盖和自动式热盖。而「可调节式热盖」利用手拧压紧式,拧不紧会发生试剂蒸发,一些厂家通过增加热盖压力以减少边缘蒸发,但该方法并不能完全消除这一现象,有时拧得过紧反而可能出现压坏管子、拧坏旋钮的情况,有的仪器甚至会因拧得过紧而导致试剂蒸发。也有一些厂家通过在热盖上增加软性导热材料来解决这一问题,但目前,软性导热材料的使用寿命无法明确。


通常,采用电动智能热盖,能够自动感应不同高度的耗材,自动压紧耗材,压力均匀且恒定,从而能够减少试剂蒸发和人工误差,提高实验准确度和可重复性。



2、耗材形变


尽管目前通过热盖技术大大防止了体系蒸发,但在反应溶液的总体积仅有 3~5 μL 的情况下,由蒸发带来的影响依然十分显著。


PCR 孔板通常为塑料材质,在受热后发生膨胀,产生较大地变形,用于放置 PCR 孔板的 PCR 金属基座则受热膨胀率极小,如图所示,PCR 孔板受热膨胀后不能正常沿平面延展进而中间形成拱起状态,从而造成上方热盖不能全面地与 PCR 孔板上表面充分接触,造成温度、压力不均,引起 PCR 孔板边缘试剂的蒸发,影响 PCR 检测效果。




3、耗材密封不严


热盖与耗材压紧并不等于盖紧了 PCR 管盖,PCR 孔板质量参差不齐,一些孔板的盖子本身密封不严,即使使劲盖,也没有用。同时,开关盖过程繁琐,有时还会造成漏液、气溶胶污染。

传统解决蒸发问题的办法:


1.放大反应体系:例如 10 μL 的体系改成 20 μL;


2.在试剂表面加石蜡油:添加石蜡油不仅增加实验步骤,还影响样品的下一步应用。


于是,方便易封、防蒸发的封膜仪和热封膜成为不二选择。


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