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血清是否需要灭活?关于血清热灭活的争议

血清热灭活非必要


  血清热灭活的步骤在1970年代就已建立,至今成为很多实验室的常规血清前处理步骤;但许多先前认为必须热灭活的原因,却早已经不再成立:




血清热灭活的争议



至少70%的研究者对血清的灭活仅仅是因为遵照常规操作,或者说认为是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等,其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高,许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立,只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。



热敏补体与热灭活

热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质,但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。专业人士曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定,他们发现胎牛血清中含有的C1,C6仅达成年动物血清的1-3%,而其它补体成分仅有成年动物的5-50%,至于补体的主要成分C3在胎牛血清中则几乎不能检出。通过补体固定实验,我们也在多个不同批次的胎牛血清中获得了相似的结果。即使是在未稀释的血清中,也未发现有明显的溶血现象。另外,多数实验室在培养前将培养液进行预热的过程,也对热敏的补体有灭活的作用。



支原体与热灭活

在对补体灭活以外,热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。多年以前,450纳米孔径的滤膜被用于加工血清时,血清中支原体的污染时有发生。针对这个问题,CellMax使用100纳米三层滤膜连续滤过技术,自从采用这项技术以及后来的40纳米滤过技术之后,我们的血清产品中没有再发现有支原体的污染,也是使得热灭活成为不必要的另外一个原因。


胚胎发育与热灭活

血清去除灭活步骤不影响牛胚胎的发育分化;有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用,在用SV-BHK、BALB-3T3、CV-1、FS-4细胞对细胞粘附实验中,热灭活对胎牛血清的影响小于对小牛血清的影响。


细胞株生长与热灭活

我们调查了热灭活对胎牛血清以及对其中不同细胞株生长能力的影响。通过比较11个不同细胞株,发现其中热灭活对6个细胞株(HBAE,MDBK,Vero,成纤维细胞,MRC-5)的生长带来负面影响,三个细胞株(FOX-NY,MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响,而只有两个细胞株(Balb/3T3,Sp2/0Ag14 hybrid),在热灭活之后,细胞生长有轻微的改善。所以,在正常的操作下,热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。


沉淀与热灭活

在正常操作下,热灭活经常给血清产品带来负面的影响,对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生,而导致的沉淀又常常被认为是微生物的污染。注意到这个现象之后,为了验证污染的存在,或者促进沉淀的溶解,许多培养者往往将血清放置37℃温育。这却往往使情况变得更糟,血清中的蛋白进一步的析出,为了确信血清未被污染,进行的镜检,无菌培养试验,和革兰氏染色试验更是浪费了实验者大量的时间和精力。


结论

总之,多数细胞培养中血清的热灭活并不是必要的。很多场合下,热灭活并不会改善细胞的生长,却降低了支持细胞生长的能力。即使在少数有促进的情况下,其促进的比率也是微不足道的。另外,血清的热灭活导致的沉淀常常被认为是微生物的污染,从而给用户和供应商都带来不必要的麻烦。我们建议,对于那些对血清进行灭活的用户,需要通过试验来证实其必要性,确定灭活的适当条件;在灭活过程中,需要严格认真监测,并选择一个可重复的方案进行操作。

我的细胞一定要用灭活血清怎么办?

血清热灭活操作步骤



①选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。
②对照瓶内放入与血清等体积的水。

③温度预试。对照瓶内插入2—3支经挑选的温度计(保证测试温度的准确性),放入水浴箱中,接通电源,调节温度控制钮,使水浴箱温度所示温度保持在56℃。

④血清灭活。血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中,待温度计所示温度上升至56℃时, 定时30分钟。

⑤大瓶血清灭活后,进行分装。

⑥保存。分装后,抽样做无菌试验,-20~-70℃保存。

血清热灭活注意事项




灭活时,水浴槽水面与血清液面等高。

  使用水浴槽时,大多数人为避免血清瓶浮起来,会减少水浴槽内的水量,让水面降低;数据显示,降低水面也会使瓶内加热不均、拉长加热时间,增加血清破坏程度;所以还是建议将水浴槽内水量增加,让水面与血清液面等高,让血清最大面积的接触水流,增加灭活效率!


灭活后,使用冷水浴降温!  

灭活后如果直接放在室温或4度冰箱冷却,仅靠空气传导散热,冷却效果差,使得实际加热时间拉长,对血清的影响较大;反之,流动的冷水浴散热速度较快,冷却效果佳,缩短降温时间的同时,也减少对血清的破坏。




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