科研星球

人—心脏组织细胞悬液制备

心脏组织背景介绍

心脏是一中空的肌性器官,是血液循环的动力器官,主要由心肌构成,有四个腔,包括:左心房、左心室、右心房、右心室,左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开,故互不相通,心房与心室之间有瓣膜,这些瓣膜使血液只能由心房流入心室,而不能倒流。心肌细胞为短柱状,一般只有一个细胞核,细胞之间有闰盘结构,该处细胞膜凹凸相嵌,并特殊分化形成桥粒,彼此紧密连接。心肌细胞之间细胞外基质成分的分布和排列是一个多层次、多方位的网络结构,称为心肌基质网络。这个网络结构主要由心肌纤维间隙中的成纤维细胞合成和分泌的I型和III型胶原蛋白形成的纤维组成,其中大部分是I型胶原蛋白形成的粗纤维,伸展和回弹性较小,而III型胶原蛋白形成的细纤维伸展和回弹性均较大。这两种纤维组成的网络不仅包绕每个心肌细胞,也连接相邻的心肌细胞、心肌细胞群和毛细血管。

综上,心脏组织含大量胶原蛋白,本次解离主要使用罗氏Liberase TL酶,其中含胶原酶和中性蛋白酶,可提高心脏组织解离的质量和可重复性,并提高细胞活力和功能。此外,心脏细胞解离时多建议抽核,主要原因是成体心肌细胞体积大(长杆状,长100-150 μm, 宽20~30 μm), 远超过常规体细胞(近球形,直径<30 μm),目前主流的商用单细胞平台都难以捕获此类大细胞。

0.png

心脏组织示意图

材料和试剂耗材

1、试剂耗材0 (1).png2、溶液配制0 (3).png实验流程

  1. 将组织转移到含有 1 mL DPBS的培养皿中,在不损坏心包层的情况下小心地清除脂肪等非目标组织。
  2. 使用手术刀将组织切碎成大约2 mm的小块,大约200 mg。
  3. 切碎的组织转移到装有消化缓冲液的1.5 mL EP管,尽量减少DPBS带入,用封口膜密封EP管。
  4. 将EP管放入水浴中,并在37℃下搅拌消化15 min,每5 min从水浴中取出并用手轻轻摇晃。
  5. 消化完成后,将EP管放在冰上,并用5 mL移液管吹打。上下吹打 5-10 次。
  6. 通过100 µm细胞过滤器过滤溶液。使用1 mL柱塞通过过滤器轻轻搅动组织。用8.5 mL DMEM洗涤过滤器至终体积为10 mL的细胞悬液。
  7. 如果样品加到Chromium控制器中,则使用70 µm滤膜过滤溶液,用另外5 mL DMEM 清洗滤膜。
  8. 300 g,4℃离心5 min。
  9. 弃去上清液,用10 mL DPBS + 2 % FBS清洗沉淀,加入2.86 mL Percoll 溶液,制成27 % Percoll-cell 溶液,将溶液转移到高速离心管中并准备平衡管。
  10. 在4℃下以15000 g离心20 min,中断选项设置为4(或减速)。
  11. 使用1 mL移液器收集细胞,在DPBS + 0.04 % BSA中清洗细胞,并重悬在100 μL DPBS + 0.04 % BSA中。
  12. 取适量悬液加入染色缓冲液(AO/PI或者台盼蓝)评估细胞活力,调整浓度并继续执行10X操作 。

心脏组织解离大多情况需抽核,核分离流程如下

  1. 从储藏室中取出切碎的组织并置于干冰上。
  2. 将组织块转移到预冷的Dounce匀浆器 (7 mL)中并加入3 mL HB。用松杵8次敲击和紧杵8次敲击均质。保持在冰上以避免加热。如果均质化不完全,需添加敲击次数(取决于组织的数量)。
  3. 将匀浆的组织通过40 μm细胞过滤器过滤到50 mL管中,用2× 1 mL额外的 HB清洗均质器。
  4. 在4℃下,以500 g离心5 min以获得细胞核沉淀,完全去除上清液。
  5. 将细胞核沉淀重新悬浮在1 mL SB中,用2滴 NucBlue 染色悬浮液,等待10 min染色。
  6. 继续进行流式细胞仪分选到带有200 μL SB 的 EPPi管中,设置gates以选择DAPI染色的细胞核。排除小于1 µm的颗粒,以去除小碎片和损坏的原子核,排除双峰和不规则形状的碎片。
  7. 将分选的细胞核以500 g的速度在4℃下离心5 min以获得颗粒,完全去除上清液,在100 μL SB中重悬。
  8. 使用Countess和台盼蓝对细胞核进行4次计数。调整浓度并继续加载到10X芯片。

结果展示

0 (2).png

注:心脏组织细胞较大,一般采用抽核解离。



QQ客服
电子邮箱
淘宝官店
没有账号?