背景介绍

食管：是消化管道的一部分，上连于咽，沿脊柱椎体下行，穿过膈肌的食管裂孔通入胃，全长约25厘米。依食管的行程可将其分为颈部、胸部和腹部三段。食管由黏膜、黏膜下层、肌层、外膜组成，其中黏膜由上皮组织、固有层（主要为结缔组织）和黏膜肌层组成。黏膜下层主要由结缔组织构成，其中富含食管腺，食管腺周围常有较密集的淋巴细胞和浆细胞，甚至淋巴小结。肌层分为内环行和外纵行两层，都由肌肉组织组成。

本实验使用两性霉素B清除食管上残留的微生物，胶原蛋白酶消化食管组织，胶原酶提供广泛的蛋白水解活性，但优先切割细胞膜外的蛋白，所以基本上保持细胞完整。

食管组织及结构示意图

实验试剂及耗材

实验步骤

1. 实验试剂准备：

• PBSA: 两性霉素B 溶解于PBS，至终浓度为 2.5 μg/mL
• 5mL DMEM 准备:
• 1份胶原蛋白酶 (100uL 浓度为 150U/mL) 工作浓度为 3U/mL
• 1 份DNA酶(100uL 浓度为 2000U/mL ) 工作浓度为40U/mL
• 10% 胎牛血清
• 1% L -谷氨酰胺
• 1% 抗生素抗霉菌溶液
• DMEM
• DMEM培养基（空）
• 红细胞裂解液：
• 1mL 红细胞裂解试剂+ 9mL水

1. 用PBSA清洗组织

2. 用手术刀将组织切碎

3. 将切碎的组织转移到含有胶原蛋白酶溶液和DNA酶溶液的50 mL离心管中

4. 在 37°C 下以 110-150 rpm 的速度摇动悬浮液 60 min

5. 15、30和60min后用容量递减的移液器（25、10和5 mL）反复吹打

6. 用移液枪吸去上清

7. 用70um 滤膜过滤

8. 加入 10mL DMEM（空）过筛并用注射器柱塞推动。

9. 上述步骤在冰上进行

10. 1500rpm 离心 5min，弃培养基上清

11. 用红细胞裂解缓冲液中重悬细胞沉淀， 4°C下孵育10 min。

12. 加入 10mL DMEM（空）并反复抽吸

13. 使用无菌注射器和40μm滤膜过滤液体

14. 1500rpm 离心 5min，弃培养基上清

15. 在 1mL 细胞悬浮缓冲液中重悬细胞沉淀

16. 使用台盼蓝血细胞计数仪分析细胞的数量和活力

结果及注意

细胞量：81万左右，活率95%以上，结团率12%

注：食管癌组织在取样的时候，要尽量避免掺入食道软骨或黏膜等组织，这些组织存在会使细胞悬液的杂质量增多，以及影响酶解效果