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人-肾脏组织单细胞悬液制备

注 |  以上操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考,实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整。


肾脏组织背景介绍

肾脏为成对的扁豆状器官,红褐色。肾脏一侧有一凹陷,叫做肾门,它是肾静脉、肾动脉出入肾脏以及输尿管与肾脏连接的部位。肾表面包由被膜,由结缔组织构成,又称肾纤维膜。由肾门凹向肾内,有一个较大的腔,称肾窦。肾窦由肾实质围成。肾脏内部的结构,可分为肾实质和肾盂两部分。在肾纵切面可以看到,肾实质分内外两层:外层为皮质,内层为髓质。肾皮质位于肾实质表层,富含血管,新鲜时呈红褐色,由一百多万个肾单位组成。每个肾单位由肾小体和肾小管所构成,部分皮质伸展至髓质锥体间,成为肾柱。

肾单位是肾脏结构和功能的基本单位,由肾小体和肾小管所构成。肾小管汇合入集合管,肾小体包括肾小球和肾小囊。每个肾小体均有两个极,血管出入称血管极,相对的一端与近端小管曲部相连,称为尿极。泌尿小管之间的结缔组织称肾间质。皮质内间质较少,髓质内增多。间质内的纤维主要有I型、III型和VI型胶原蛋白组成。I型胶原蛋白分子上结合着糖胺聚糖,构成带状的胶原纤维。III型胶原蛋白形成网状纤维,位于泌尿小管周围。VI型胶原蛋白参与构成基膜。基质主要由糖胺聚糖和间质液组成。

该方案中使用4型胶原酶和A型胶原酶混合后的混合酶液。因为胶原酶提供广泛的蛋白水解活性,但优先切割细胞膜外的蛋白,所以基本上保持细胞完整,此外在消化酶液中,有来自大豆的胰蛋白酶抑制剂,旨在限制胶原酶混合物中胰蛋白酶蛋白的活性(会破坏细胞的完整性)。除了DNAse外,还有5 mM CaCl2(一种胶原酶活性的激活剂),可以消化死细胞释放的DNA,减少细胞结块。

肾脏组织及组织示意图

材料和试剂耗材

1.仪器耗材

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2.胶原酶混合液配制

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实验流程

  1. 将肾脏组织转移至预冷的PBS缓冲液中。

  2. 继续在冰上操作,将预冷的手术刀片或剪刀将肾脏组织切割成1 mm3左右的组织小块。

  3. 将10 mg左右已切碎的肾组织放在培养皿中,然后转移到1.5 mL试管中,加入1 mL混合酶液,混合酶液必须先放在冰上进行预冷。

  4. 每1 min晃动一次试管,从第2分钟开始每3分钟研磨10次。可将枪头前端用剪刀剪成宽口枪头,移液枪调至700 µL。

  5. 在冰上孵育30 min后,转移到冰上沉淀1 min

  6. 去除80 %左右体积的上清液,并将剩下的液体直接用30 μm的滤膜过滤,并用5 mL左右预冷的4 % PBS/BSA清洗过滤器

  7. 洗脱下来的液体(含有细胞)转移到15 mL大号离心管中,并同时添加预冷的0.04 % PBS/BSA至总体积为10 mL。

  8. 冷冻离心机4℃,650 g离心5 min后,去除上清液,将细胞重悬于10 mL的4 % PBS/BSA,并置于冰上。

  9. 向含有组织块的试管中添加额外的1 mL混合酶液。每3 min研磨10次,每分钟摇动一次,同时在冰上孵育

  10. 50 min后(总计1 h 20 min),将全部体积的消化混合液通过新的30 μm滤膜,过滤至50 mL的离心管中,用5 mL预冷的0.4 % PBS/BSA冲洗过滤1-2次

  11. 将液体转移至15 mL锥形管。用0.04 %预冷的PBS/BSA将体积调到10 mL。将此管和前一层的管(两个管)离心(650 g,5 min,4℃),去除上清液。

  12. 如果组织含有大量的红细胞,需要加入美天旎裂红试剂盒(Miltenyi Red Blood Cell Lysis Solution,货号130-094-193)进行裂红操作,具体操作参照试剂盒说明。

  13. 4℃,650 g离心5 min,去除上清,只留下100 μL体积

  14. 加入0.04 %预冷的PBS/BSA至10 mL,4℃下650 g离心5 min,尽可能多的去除上清

  15. 在冰上,用100 µL预冷的0.04 % PBS/BSA重悬细胞悬液,然后取适量悬液,采用台盼蓝或荧光计数法对细胞数量和活性进行检测

结果展示

所获细胞悬液:活率大于93 %,结团率较低,背景干净。

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注:肾脏组织较脏,在解离过程中注意清洗干净,同时肾脏中线粒体比例相对较高,解离过程中如细胞量足够最好做去死细胞处理。



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