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qPCR实验疑难杂问解答

看了别人文献里的PCR方法,照搬了人家的引物,还是做得每次结果都不一样?不是Ct值出现过晚,就是扩增曲线变化很奇怪,总是操作过程中时不时有这样或者那样的问题,遇到这些问题怎么处理呢?实践出真知,今天给大家汇总一下qPCR常见的疑难解答,看下方详细介绍:


疑问1:Ct值出现过晚(Ct>38)


答:


  1. 扩增效率低,反应条件不够优化,降低退火温度,增加镁离子浓度。

  2. 反应成分降解或加样量不足

  3. PCR产物过长,一般采用80-150bp.


疑问2:标准曲线线性关系不佳


答:


  1. 加样存在误差,是样品浓度不成梯度。

  2. 标准品出现降解,避免反复冻融。

  3. 引物或者探针设计不佳。

  4. 模板中存在抑制物或模板浓度过高。


疑问3:溶解曲线存在多个主峰


答:


  1. 引物设计不够优化。

  2. 引物浓度不佳,上下游引物浓度比例不一致。

  3. 镁离子浓度过高。

  4. 模板基因组的污染。


疑问4:同一样品中,其中某一个荧光信号特别强。


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答:


  1. 试剂配制时反应液没有完全溶化,导致探针量在一管增多。

  2. 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。

  3. PCR仪热槽被荧光物质污染,需要清除热槽中的污染。


疑问5:扩增曲线有一向上或向下的尖峰?


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答:


  1. 反应过程中电压不稳定

  2. 可能在20个循环左右时,仪器有停下或仪器有开盖,使光线突然增强

  3. 如果尖峰向下,可能是由卤素灯老化所致,这时应更换。

疑问6:部分样本扩增效率过低?


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答:


  1. 提取液残留,一定程度抑制了PCR反应

  2. 反应液未严格取量混匀或分装不均匀

  3. 试剂失效

疑问7:阴性对照或空白对照翘尾


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答:


  1. 模板提取环境或操作过程有污染

  2. 配液过程存在污染

疑问8:直线型扩增曲线


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答:


  1. 探针部分降解:一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月,探针的反复冻融或导致降解;或者探针在光线下暴露时间太长了。

  2. 反应液中有PCR抑制物。

疑问9:没有扩增曲线


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答:


  1. PCR参数设置错误,在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步,即stage1阶段

  2. 电脑设定了自动休眠


疑问10:基线下滑


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答:基线选取范围不对,可试着将基线范围改大一些,这一问题常因试剂质量所致。


疑问11:扩增曲线断裂


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答:基线选取范围不对,基线终点大于Ct值,这通常是由于模板DNA浓度过高所致,因Ct值<15,而基线范围仍取3-15,其中包含部分扩增信号,导致标准差偏大,阈值过高,解决办法:减少基线终点至Ct前4个循环,重新分析数据。


疑问12:样品浓度跨度过大


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答:样品浓度过高,导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线,其解决方法同“扩增曲线断裂”。


疑问13:山坡形曲线


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答:常因反应管封口不严,至反应液蒸发所致。


疑问14:如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性?


答:


  1. 首先确定模板RNA完整性好,无DNA污染。

  2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂

  3. 为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。

  4. 使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

  5. 若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

  6. 设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构。


疑问15:避免RNA降解的方法有哪些?


答:


  1. 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA

  2. 使用良好无污染技术分离RNA

  3. 将组织从动物体取出后立刻提取RNA,并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。


疑问16:RNA中含有逆转录抑制剂时,怎么处理?


答:逆转录抑制剂包括:SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐,可将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂;若对照RNA与样品混合后产量降低,则说明样品中存在逆转录抑制剂,可用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗,以除去抑制剂。


疑问17:如何解决合成cDNA第一链合成的引物退火不充分?


答:确定退火温度适合实验中所用的引物。如随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10min。


疑问18:如何减少RNA模板中的二级结构?


答:


  1. 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火;提高逆转录反应温度。

  2. 温度超过60℃时,不能使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP

  3. RT-PCR产物的长度超过1kb时,反应温度需保持在65℃。


疑问19:RNA中有DNA污染的处理方式


答:


  1. 若是基因组DNA的污染,可使用DNaseI处理RNA; 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。

  2. 若是受到外源DNA的污染,可使用抗气雾剂和UDG酶。


疑问20:qPCR探针设计的一般原则有哪些?


答:


  1. 扩增片段的长度不应太大,一般小于300bp。

  2. 探针不能和任一引物互补,且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短,长度不要超过30bp。

  3. 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度

  4. 探针如用于检测多态位点,多态位点应尽可能靠近探针中部

  5. 探针5’端不能是碱基G,G对荧光基团有猝灭作用。

疑问21:在无反转录酶的情况下,对照RNA仍获得扩增结果


答:


  1. 体外转录时不可能将所有DNA模板消除,因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。

  2. 可能是引物二聚体的条带。


疑问21:扩增产物滞留在加样孔中


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答:


  1. 可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增。

  2. 在二次PCR时,使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃,可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。


疑问23:无Ct信号出现


答:


  1. 反应循环参数不够,一般要在35个循环以上,但是过多的循环次数可增加背景值。

  2. 检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法(SG法)采用的是72℃延伸时采集荧光信号,taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

  3. 引物或探针降解,可用PAGE电泳检测其完整性,若是电泳条带呈弥散状,可考虑重新合成引物或探针。

  4. 模板不足或降解,则可以重新提取核酸模板。


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