Western Blot虽是实验室最常用的蛋白分析技术，由于其操作流程长，影响因素多，想获得准确、一致的漂亮结果也并非易事。相信大家都遇到过信号若隐若现、背景糊成一片、条带极其诡异的情形。针对高频WB异常结果，我们分析了常见原因及优化建议，让你的条带显露真身。
信号弱或无信号
化学发光底物选择不当或失效
解决方案
✦ 更换灵敏度更高的WB底物再次检测。例如低fg级灵敏度的SuperSignal Femto超敏化学发光底物。
✦ 通过暗室实验排查WB底物的效价。混合发光底物的A/B液，在暗室中加入1µL未稀释的HRP二抗，如果很快看到蓝色亮光，说明底物没问题；如果没有看到蓝色亮光，可再更换一支新鲜二抗再次检测，如果这次看到有蓝色亮光，则说明刚才所用的二抗有问题，如果依然没有蓝色亮光，则说明底物效价可能变低或者失效了。
底物效价变低通常有两种原因：
✦ 保存不当。通常建议在4度或室温下保存底物（以厂商说明书为准），如果放在了-20度下，或冷藏室的通风口/内壁这种温度较低的位置，容易发生底物灵敏度降低的状况。
✦ 交叉污染。使用同一个移液管或枪头吸取底物A/B液，这样会造成交叉污染，随着时间延长，进一步造成底物的消耗。
抗体亲和力弱或浓度过低
解决方案
✦ 所用抗体与目的蛋白结合力低。说明书上的抗体浓度一般为推荐使用浓度，由于样本以及实验条件的不同，推荐浓度不一定是自己实验中合适的抗体浓度。在出现没有信号的问题时，可以通过斑点印迹实验（下文详述）来寻找合适的抗体浓度。需要留意的是，如果一抗或者二抗浓度过高，容易导致低信噪比（高背景或者杂带很多），也会因此浪费更多样品和精力。所以抗体浓度并不是越高越好；此外，还可尝试使用信号增强剂以提高印迹的信噪比；在经费允许的条件下，也可直接更换品质更好的抗体再次检测。
✦ 抗体效价降低或已失效。可通过斑点印记实验（下文详述）重新确定合适的抗体浓度，或者更换抗体。
转印不充分或转印过度
理想条件下，转膜后只会在膜上看到预染marker条带，在胶或滤纸上几乎没有条带的存在。
解决方案
如果在胶上看到有大量蛋白Marker残余，膜上marker条带较浅，则说明转膜不完全。那么可通过以下方式进行优化：
✦ 增加转膜的电压、电流或时间
✦ 降低凝胶厚度，如从1.5mm改为1.0mm
✦ 对于大分子量蛋白的转印，可以在转膜液中添加低浓度的 SDS（一般<0.1%），或适当降低转膜缓冲液中的甲醇浓度至10%或更低
如果怀疑信号弱是由于转膜过度，可通过以下优化方式再次尝试，帮助排查原因：
✦ 减小转膜的电压、电流或时间
✦ 选择孔径更小的膜（如0.2µm）
✦ 对于小分子量蛋白的转印，确保转膜液中不含SDS，适当提高甲醇浓度（20%）
封闭液不合适
解决方案
不同的体系需要不同的封闭液。不是所有检测系统（HRP/AP/生物素）都适合用脱脂牛奶或BSA进行封闭。对于相同的检测系统，同一种封闭液在不同蛋白上的封闭效果也是不一样的。所以一个检测体系的最优封闭液是需要测试与优化的。
图1. 不同封闭液对同一种蛋白的封闭效果不同，对不同的蛋白使用同一种封闭液进行封闭的效果也存在差异。
如果已验证底物没有问题，这些情况通常是由于二抗浓度过高引起的。二抗是加得越多信号越好吗？No！No！No！这可是常常被忽略的一个要点。通常，化学发光的信号强度与持续时间取决于系统中酶与底物的比例，而底物浓度是恒定的。在这种情况下，酶的浓度过高不仅不能增强信号，反而会导致底物迅速消耗，信号很快就没了。这样稍不留意，得到的就是没有信号的结果。如果选用的酶与底物比例合适，也许开始时信号强度不是很高，但信号持久度和稳定性会很好，可帮助获得重复性更好、更理想的结果。所以，二抗的浓度要适宜。
解决方案
既然合理的一抗/二抗浓度很重要，那么应如何优化抗体浓度呢？推荐进行斑点印迹。
现在我们拿到了两张信号图，应该如何分析来选取合适的抗体浓度呢？
Ø 若两次曝光的信号都很弱，如E3和E4，说明膜条3和4所用的一抗浓度过低（1:5K稀释）；
Ø 若第一次曝光信号很好，第二次曝光信号迅速衰减，如A1和B1,说明膜条1和2所用的一抗/二抗浓度过高；
Ø 若两次曝光的信号都比较好，结果稳定，如B2和C2，说明对于膜条2所用的一抗和二抗稀释比是合适的
此外，即使是同一张膜条（如膜条2），不同点的信号强度与持久度也有所区别，这说明抗原浓度也会影响信号，样品浓度过高时会结合更多的一抗，进而结合更多二抗，造成信号迅速衰减。所以上样量也不是多多益善的。
成片状高背景，条带信号强
一抗浓度过高或者特异性低
解决方案
通过点膜实验优化一抗的浓度（见上文详述）；更换特异性更好的一抗。通常单克隆抗体的特异性会高于多克隆抗体。
蛋白样品的丰度过高
解决方案
适当减少蛋白样品的上样量。
封闭液不合适
解决方案
同上文详述。
不规则高背景
漂洗不充分
解决方案 增加洗膜次数和洗膜时间，并确保漂洗缓冲液的体积完全覆盖印迹膜。此外，可在漂洗缓冲液中加入0.05% Tween-20。但如果Tween-20的浓度过高，可能导致膜上的蛋白剥离。所以切勿在StartingBlock T20封闭缓冲液和SuperBlock T20封闭缓冲液中再额外加入Tween-20。因为这两种封闭缓冲液中已含有Tween-20。 Tips 部分区域有空白 转印过程操作不当 解决方案 确保转印过程中凝胶与膜充分接触，推荐使用印迹滚筒来赶气泡；如使用PVDF膜，确保膜充分浸润和活化；保证除去胶与膜之间的残胶、碎胶；避免膜在操作过程中变干；操作时避免手与膜的直接接触，全程使用干净的设备（镊子和剪刀等）。
转自：赛默飞生命科学
