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出现两条带的beta-actin究竟对不对?

身为内参界的大腕,β-actin凭借稳定单带的优点集万千宠爱于一身!

然鹅,万万没想到,β-actin也有“掉链子”的时候!那出现两条带的beta-actin究竟对不对呢?




我们先来看下面这两个 β-actin的检测:

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(图片来源于网络)


第一个图中一条带的 β-actin 的正确性是毋庸置疑的,但是第二个图中actin俨然不止一条带。我们先来看看这个问题是否普遍存在:


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作为内参的 β-actin多条带问题这么普遍,那究竟是什么原因呢?



原来科学家们发现,有很多酶都可以降解actin(由于不同actin亚型序列差别不大,所以下面统称actin。这一系列酶的种类多得超乎你想象!


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除了这些酶的作用,在有些特殊的刺激下,比如凋亡,actin也会降解!


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咱们熟悉的42 kDa的actin,发生降解后会产生35-38 kDa、~30 kDa, 15 kDa等典型片段来,其中35-38 kDa的片段最为常见,这是因为不少酶都会在Val43和Met44这两个氨基酸中间切开它,也就是下面这个意思:


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综上所述,如果actin出现多条带,建议从以下几个方面考虑解决:

1. 像上面提及的凝血酶、组织蛋白酶等在各组织里和细胞里的分布比较广泛,在裂解过程中它们极有可能是降解actin的主要因素,因此需要设法抑制蛋白酶活性,比如引入蛋白酶抑制剂、避开蛋白酶最适活性温度等;

2. 对于贴壁细胞,在传代过程中使用的胰酶也是一个潜在威胁,在传代的时候需要控制好消化时间,防止消化过度,尤其是在最后一次传代时,细胞密度尽量传低,以充份稀释残留的胰酶,同时提高未被降解的细胞的比例。

3. 保持细胞处于良好的状态,防止发生凋亡。对于研究凋亡的童鞋来说,可以考虑用其它内参

4. 防止细胞被微生物污染、防止裂解产物被微生物污染,提蛋白的全部器皿尽可能干净无微生物污染。


但是,针对富含大量蛋白酶的组织(如消化系统组织)和细胞(如U-937, Raw264.7等细胞),即使用了上述方法,依然有较大可能出现actin被降解的可能。那怎么办?


不用担心,Proteintech已经完美解决这一问题!

我们来看看Proteintech的两支 β-actin单抗:


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Proteintech的60008-1-Ig可以识别出一条降解片段来,但是66009-1-Ig只能测出全长来,原因就是66009-1-Ig识别的位点位于前43aa内。

所以,当实在无法解决beta-actin出现降解条带但又需要漂亮图图的,如果确认目的蛋白不受降解影响或影响极小的,可以考虑采用Proteintech 的66009-1-Ig来解决。



另外需要注意的是,N端的序列在物种间的保守程度不如C端,因此Proteintech 的 β-actin抗体60008-1-Ig可以识别更广泛的物种,最低可以识别酵母actin, 而66009-1-Ig只能识别线虫或更高等的动物。

为了方便大家选择产品,我们顺便把这两个产品的对比列出来:


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(注意:60008-1-Ig亚型为IgM,不适合做IP实验。)



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