知己知彼，百战百胜。想要获得目的蛋白，首先得了解它到底是如何表达的：组成型表达？还是诱导型表达？时空表达谱有什么特点？

案例分析 1

事件：2019年7月，客户反馈Proteintech品牌SURVIVIN抗体（货号：10508-1-AP）做WB实验检测小鼠肝脏没有条带。

结果：经多篇SCI文献确认，同时Proteintech 质检人员复检确认，SURVIVIN蛋白在正常成年小鼠肝脏中基本不表达。

案例分析 2

事件：2018年5月，客户反馈Proteintech品牌IDO1抗体（货号：13268-1-AP）做WB实验检测Hela细胞没有条带。

结果：经查阅文献资料，同时Proteintech质检人员复检确认，HeLa细胞中IDO1蛋白需要在IFN-γ的刺激下，才会有较高水平表达。

知识点： 实验前，可通过调查相关文献以及网站，查看靶标蛋白的时空表达情况，确保实验方案正确。常用的蛋白数据库有：

UniProt（https://www.uniprot.org/），一个十分强大的蛋白数据库，可了解靶标蛋白基因信息、别称、功能、可变剪切、定位及可修饰类型等；

HPA（http://www.proteinatlas.org/），The Human Protein Atlas，简称HPA数据库，主要通过免疫组化技术确定人体组织和细胞中的蛋白表达水平和分布；    

BioGPS（http://biogps.org/），一个基因&蛋白信息数据库，可通过基因的mRNA表达水平参考不同样本中靶标蛋白的表达水平。

Expasy（https://www.expasy.org/）一个蛋白质在线分析平台，可根据蛋白序列信息预测其分子量、等电点、亲/疏水性等相关信息。

另外，Paxdb数据库，NCBI综合数据库、UniHI蛋白互作数据库等同样也可在线分析靶标蛋白相关信息。

电泳阶段，上样操作是区分新手和老手的关键点，偶尔的小失误会导致条带畸形或者串样，但不会导致白板；转膜阶段，合适的膜孔径和正确的电极方向是成功关键。

案例分析 

事件：2016年11月，小编亲身经历，转膜时“三明治”方向放反，导致蛋白全跑到电泳缓冲液中，膜上一片空白（类似下图）。

知识点： 电泳阶段，电泳缓冲液需要现配现用，另外上样量要充足；转膜阶段，首先要根据靶标蛋白分子量大小选择合适孔径的膜（＞20kD,选择0.45um孔径；≤20kD,选择0.22um孔径），并且大分子蛋白迁移速度相对较慢，可适当延长转膜时间，小分子蛋白迁移速度相对较快，要防止转膜过度；其次注意电极方向，正确顺序为：负极-海绵层-胶-膜-海绵层-正极；另外，可通过丽春红染膜（可逆）和考马斯亮蓝染膜（不可逆）来判断转膜是否成功。

转膜封闭完成后，选择合适的一抗使用合理的稀释度进行孵育，是WB实验成功的关键。

案例分析 

知识点： 一抗选择时，(a)要确认靶标全称（full name）,很多蛋白缩写相同，且有异构体或者被修饰，要确认抗体名称和靶标名称对应；(b)认准抗体类型，根据需要挑选抗体种属来源，兔多抗、鼠单抗,,,,,(c)确认适用种属，由于蛋白序列保守性和差异性，有些抗体能识别多种物种，有些则不能；(d)确认应用范围，适合WB实验的不一定适合FC，根据产品公示应用范围确认抗体能否进行自己需要的实验 。一抗使用时，a) 根据抗体说明书推荐的稀释度和孵育条件（包括温度、时间）合理孵育；b) 按照说明书推荐温度、推荐方式储存抗体，防止抗体失效。（当然：挑选抗体的最好方法还是打电话给抗体客服，让他给你直接推荐。）

合适的一抗需要搭配合适的二抗。

案例分析 

事件：2019年7月，客户反馈Proteintech品牌GAPDH内参抗体（货号：60004-1-Ig）做WB实验没有条带。

结果：经Proteintech技术支持确认产品反馈表发现：GAPDH抗体（货号：60004-1-Ig）为鼠单抗，而客户采用的二抗为“羊抗兔”。

知识点： 二抗选择遵循一个标准：一抗是什么种属来源，二抗就抗什么种属。一抗是兔多抗，二抗选择抗兔；一抗是鼠单抗，二抗选择抗鼠......二抗使用时同样需要根据抗体说明书推荐的稀释度和孵育条件（包括温度、时间）合理孵育，按照推荐条件和温度储存。

抗体孵育完成后，进行显影。根据实验需求选择合适显影手段，以最常用的ECL化学发光检测试剂盒为例。

案例分析 

知识点： 显影时，根据蛋白丰度选择合适的ECL检测试剂盒，低丰度蛋白选择超敏级ECL试剂盒+长曝光，防止信号丢失出现白板；高丰度蛋白选择普通级ECL试剂盒+短曝光，防止过曝出现杂带；另外，叠氮钠对HRP有抑制作用，会影响显色效果；显影液过期或者配置错误也可能导致WB实验结果无条带。