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细胞手工计数方法要点及注意事项

细胞计数作为医学检验的常用手段之一,也是细胞学实验室的一个基本技能。虽然现在技术人员已经开发出高科技的仪器设备,但是大部分智能化的计数仪器所采用的基本原理还是与传统手工计数法一样。


并且,仪器只对“标本”本身负责,但上仪器之前的所有细胞处理过程,都需要咱们亲历亲为的。因此,对于刚进入细胞学领域的新人来说,学会细胞手工计数这一技能,还是非常有必要的。


一、血球计数板结构

细胞手工计数板核心是血球计数板,市面上卖的一般都是有医疗器械号(国产进口均可用,不用挑哈)。血球计数板是一块比普通载玻片厚的长方形玻片,在中部1/3面积区域有4条凹槽,将中部区域分为3个长方形平台;其中正中间的平台又被一短横凹槽分隔为两半,作为两个计数池,两个计数池平台高度比两边略低0.1mm。

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在显微镜下,每一个计数池均可以看见以下网状结构,9个同面积的大方格组成方格网,大方格作为计数室(绿色蓝色方框区域)。计数室边长为1mm,盖上盖玻片后容积为:1mm(长)x1mm(宽)x0.1mm(高)=0.1mm3,即一个计数室的体积为0.1mm3,也就是1x10-4mL。我们只要把这个计数室里面的细胞数清楚,再乘以104,我们就可以得到每毫升样本中的细胞个数。

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了解了计数室的体积,咱们还需要了解计数室的刻度规格。一般一个计数室会被分为400个小方格,有两个划分形式:(1)25x16,一个计数室划分为25个中方格,每个中方格再划分为16个小方格;(2)16x25,一个计数室划分为16个中方格,每个中方格划分为25个小方格。因此,不管哪种规格,小方格的面积均为1/400mm2

接下来就是数数了。以上图血球计数板为例,该计数板左边三个参数:规格为XB-K-25,表示计数室有25个中方格,0.1mm代表计数室高度,1/400mm2代表一个小方格面积

针对红细胞和血小板的计数,通常我们会选取上图所示5个中方格(红色方格区域)内的细胞进行统计,随后取其平均数,再乘以25,即可得到计数室细胞总个数(如果不嫌麻烦直接把计数室细胞全部数完也可以哈~~),再乘以104即可算出每毫升样本中的细胞数量

针对白细胞及胰酶消化后的贴壁细胞和悬浮细胞的计数,通常我们会选取上图所示的四个大方格(绿色方格区域)内的细胞进行统计,将4个大方格内的细胞数完求和,随后总数除以4,再乘以104即可算出每毫升样本中的细胞数量。




二、手工计数操作要点

首先,计数板需要清洗干净,使其干燥,不能有油脂或者灰尘,盖玻片亦如此,不干净的计数板严重影响计数结果的准确性。

其次,提前预估细胞量,细胞浓度太低误差大,细胞浓度太大容易数花眼。最好使其浓度在0.5-5x106个/mL,也就是每个计数室50-500个细胞,细胞数目过多,则需要进一步稀释;细胞数目过少,则需要离心再悬浮。

第三,尽可能使细胞分离成单个,无团块无杂质;计数前快速吹打均匀,尤其是多次取样计数时更要注意每次都要混匀,操作尽量迅速。

第四,细胞液滴加到计数室再盖盖玻片,亦可先盖玻片,从侧面通过液体毛吸作用到达计数室,液体太多容易测流到计数板小沟,细胞容易被流走;液体太少容易在计数室或者附近形成空泡。如出现以上情况,则需准备细胞和计数板重新计数。

第五,数细胞的原则是只数完整的细胞,若少量细胞聚集成团,只按照一个细胞计算;如果细胞压在格线上,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线

第六,如果细胞需要台盼蓝染色,必须充分混匀并且不要忘记计算时乘以倍数

第七,滴加细胞过程中,滴加后移动计数板以及计数过程中都要保持计数板水平不晃动,防止细胞液体侧流带动细胞流失或者局部聚集。

第八,建议细胞计数板上下两室都计数然后取平均或者多次计数取平均,准确的计数应该是多次计数结果差别很小,或者稀释一定倍数后计数结果依然吻合。





细胞计数是细胞工作者一项基本功,现在市面上还有一次性的塑料计数板,只需要准备好细胞直接滴加到计数室即可。其原理依旧与以上玻璃计数板相同,接下来镜下数细胞的过程也是完全一样;即使使用高大上的细胞自动计数仪,还是要有一个规范的细胞样品准备和滴加过程,只不过是机器代替你数细胞和做算术而已。

小小技能,大大乾坤。细胞计数这关过不了,细胞学相关实验,比如单抗细胞融合,有限稀释亚克隆这些你就玩不转了。

所以,各位小伙伴,这一门传统但未过时的手艺,你学会了吗?


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