收藏！细胞增殖实验要点详解
2021-06-25
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实验干货
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一生二，二生三，三生万物，细胞之所以能子子孙孙无穷匮也，所依靠的就是强大的增殖能力，而癌细胞更是将这份能力运用的出神入化。因此，在一定程度上，检测细胞的增殖状况，便可判定细胞的生长状态以及活性。今天小编则汇总了一些久经考验的可靠方法来检测细胞增殖，希望各位学员能选择最适合自己的检测方式，好结果自然会水到渠成。最简单粗暴的傻瓜式检查方法！一般利用计数板或计数仪得出细胞数目，然后对数目进行比较。
该方法需要对不同时间点的细胞分别固定，而后在光镜下计数，可绘制出细胞生长曲线。而其不足之处在于无法区分增殖细胞与非增殖细胞，不适合样品数量多和评估特定亚群的情况。通过检测活细胞相关的物质的含量（如蛋白质、酶）等间接地测定待活细胞的数量来评价细胞的增殖能力，常应用于细胞活力、药物作用的毒性检测，适合高通量分析实验。一般，在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，可将外源性四唑盐（MTT、XTT、MTS、WST）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞不存在此现象；再以DMSO溶解活细胞中的甲瓒后，可通过分光光度计和酶标仪在450nm波长处测定吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。现在最常用的CCK-8法就是MTT的升级版，因为CCK-8细胞活性检测试剂中含有WST-8——一种类似于MTT的化合物，可为线粒体内的脱氢酶验明正身。细胞增殖越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。通过测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力，是目前实验室中检测细胞增殖最准确方法，如Brdu/EdU检测法，常应用于细胞DNA修复，分化及细胞标记物追踪等方面。Brdu&EdU均是胸腺嘧啶的衍生物，均可代替胸腺嘧啶选择性地整合到复制细胞新合成的DNA中，并进入到子代细胞中。不同的是，Brdu法需要DNA变性（破坏DNA双链结构），以结合特异性抗体来判断细胞增殖的速度，再结合免疫荧光染色以及其他细胞标记物则可判断出增殖细胞的种类。而基于EdU是通过与Apollo荧光染料的特异性反应来检测DNA复制活性的，而其检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内很容易就扩散，是无需DNA变性的，适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。细胞内的ATP含量是受到严格调控的，一般死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系，那么检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础。如果有ATP存在，荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。《二十四型》课程也曾讲过，围绕着分子和细胞，在对组织样本进行增殖表型的相关检测时，可通过免疫组化的方法检测增殖相关的分子标志物（增殖细胞核抗原PCNA，细胞核相关抗原Ki-67和微小染色体维持蛋白MCM等），来反映体内细胞的增殖能力。这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。而其缺点就在于需要组织切片，无法进行高通量分析。此外，考虑到肿瘤细胞的克隆形成现象，即由单独一个细胞增殖形成大量的子代细胞，并最终形成一个细胞克隆，因而也可通过克隆形成实验（colony formation assay）检测其克隆形成能力，来评估肿瘤细胞离体增殖能力的大小以及其在体外致瘤能力的大小。同样，干细胞的增殖能力也可通过干细胞悬浮成球试验（microsphere formation assay）来进行检测。CFSE是一种可穿透细胞膜的荧光染料，可逆的与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上，是种良好的细胞标记物。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此CFSE荧光强度呈对逐级递减，可利用流式细胞仪对其进行分析。
将细胞悬液加入等体积的CFSE工作液，37℃孵育10min,用40%体积的冷小牛血清立即终止标记10min，离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞即可。其实，前文所介绍的MTT以及Brdu法都属于End-point assay（终点分析法），因为这类技术对于细胞都有破坏作用，检测过程中细胞已经死亡，结构也不再完整。而RTCA（实时细胞分析法），不仅能实时检测细胞增殖数据，还可以监测整个培养周期内细胞增殖的动力学变化过程，其应用范围非常广泛。不过，RTCA 对于硬件设备的要求很高，成本高昂。肿瘤研究中，最常用的动物模型是移植瘤动物模型。以此检测增殖表型时，需要记录移植瘤的大小/体积，重量等参数。同时，也可将动物的移植瘤样本进行组织切片或匀浆抽提出总蛋白/总RNA来检测增殖相关的分子标志物的表达变化。此外，移植瘤内部细胞会因肿瘤恶性增殖所引起的高细胞密度，而无法接触到外界氧气和养分，进而形成坏死区域。因而移植瘤恶性增殖程度越高，坏死的区域也会愈加的明显。所以通过组织切片检测移植瘤内部坏死区域的面积大小，也是评估增殖的有效手段。以上就是检测细胞增殖的具体方法，至于要怎样选择最适合自己的检测方法？可以萝卜青菜各有所爱，但重要的是根据你的细胞类型和研究方案做选择。比如说，如果你已经有了待测细胞(不论是在培养板还是在溶液中)，希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，那可以使用四唑盐和比色法检测。相应的，如果你对DNA合成的改变更感兴趣，可以选择用BrdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析。或者你研究的是单个细胞，也可以用BrdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记的相应抗体结合，然后通过流式细胞仪来进行流式分选。
