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细胞凋亡实验要点详解

做实验的,大都知道细胞身娇体弱难培养,一言不合就死给你看。虽说人生百态,死法万千,但对细胞而言,谢幕的方式主要两种:凋亡和坏死。


其中,凋亡(细胞程序性死亡,PCD)则是细胞以优雅老死的方式来定格生命消逝时的最后瞬间。

具体而言,就是细胞凋亡时,胞内的各种凋亡相关分子齐聚大舞台,上演一出死亡协奏曲后,优雅地走向虚无。

而这个过程大致分为以下几个阶段:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→调节蛋白水解酶的活性(Caspase)→进入连续反应过程。

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而因启动阶段的不同,细胞凋亡往往又会兵分三路,即线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路。

线粒体是凋亡的第一个据点。在这里,Bax家族与Bcl-2家族里应外合,改变线粒体膜的通透性,让跨膜电位丢失并释放细胞色素C(Cyt C)和其他蛋白,以诱导Caspase通路级联反应。

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内质网通路,即由内质网失常引起,而非以细胞膜或线粒体为靶点的凋亡信号触发。这只队伍分了水陆两路,PERK通路和Caspase7通路。

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死亡受体通路就是各种外界因素作为细胞凋亡的启动剂,然后通过不同的信号传递系统传递凋亡信号,引起细胞凋亡。

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而为了更好将细胞生命的最后瞬间固定下来,研究者也是各出巧计,但常用的检测方法也不过六种

01

利用“放大镜”


熟知凋亡细胞的你,可通过实验室里的“放大镜”——显微镜,对行来过往的细胞进行逐个排查。

只要细胞皱缩、变形、空泡化,抑或裂解为凋亡小体,都逃不过你的火眼金睛。

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02

Annexin V/PI染色


Annexin V(Ca+依赖的磷脂结合蛋白)经常与搭档PI(碘化丙啶)染料共同捕获凋亡细胞,只要他俩一出手,总能将凋亡早晚期细胞和死细胞区分开来。

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一般它们可将细胞分为以下四种类型(见下图):

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上图是一张典型的Annexin V-PI 双染色后的流式检测结果数据:

1)Annexin V阴性且PI阴性(双阴性细胞):活细胞;
2)Annexin V阳性且PI阴性:早期凋亡的细胞;
3)Annexin V阳性且PI阳性(双阳性细胞):晚期凋亡或者是坏死的细胞;
4)Annexin V阴性且PI阳性:可能是由于非特异性染色导致的。

03

攻占“线粒体”据点,为我所用


既然线粒体是细胞凋亡的一大推手,便让我们有了可趁之机。让亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、JC-1、TMRM,渗透到线粒体中,发出强烈荧光(一般正常细胞显红色,凋亡显绿色),来作为细胞是否凋亡的指路标。

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又或者,借助试剂盒之力分离出线粒体出细胞中的线粒体和细胞质,再通过SDS-PAGE电泳对其进行分开审讯,最后用专门的抗体“锁链”——Cytochody将细胞色素C(Cytc)缉拿归案。

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04

抓住Caspcase蛋白,让凋亡细胞即刻现形


Caspcase蛋白作为凋亡通路的骨干要员,它的出现,让细胞凋亡成为了一件板上钉钉的事情。

以Caspcase3为例,正常情况下以酶原(32kD)的形式存在于胞浆中。在凋亡早期被激活后,可裂解为两个大亚基(17kD)和两个小亚基(12kD),而在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。

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当然,除了Caspcase蛋白,也可以通过凋亡其他核心通路中的骨干成员来判断(见下图)。两者相结合,细胞凋亡检测结果的准确性才能得以保证。

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05

来自DNA的提


DNA作为细胞内曾经的王者,在面临细胞全面崩溃时不仅无力回天,甚至于它本身都断裂成一段一段的。

那么细胞是否凋亡,只需要让断裂DNA从小到大排排站就可以判断了:凋亡时DNA在核小体间有规律的断裂并会产生180-200bpDNA片段;而坏死细胞的DNA则会断裂为无特征的杂乱片段。

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06

Tunel检测法


细胞凋亡时DNA双链或单链断裂会产生大量的粘性3’-OH末端。以此为线索,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)协助下,可将生物素/荧光素标记的dUTP绑定在3’-OH末端,并通过酶联显色或荧光检测来定量分析结果。

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