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考马斯亮蓝(Bradford法)测定蛋白质含量

实验概要

Bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。Coomassie brilliant blue G-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm,溶液的颜色由棕色变为蓝色,595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。灵敏度比Lowry法高4倍,与BCA法相当。反应迅速,2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。操作简便,只需要一种反应试剂。

实验原理


考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465 nm变为 595 nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。


主要试剂


考马斯亮蓝G-250染色工作液: 10mg考马斯亮蓝G-250粉末溶于5mL 95%乙醇中,彻底溶解后,加入10mL 85%磷酸中,边加边搅拌(市售液体磷酸(H3PO4)的质量分数≥85.0%,稠状透明液体,可直接使用,对皮肤有很强的腐蚀作用,建议使用5mL移液枪缓慢吸取使用)蒸馏水稀释至100mL。后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中,避光保存。长时间不用,可放置于4℃冰箱中保存1年,再次使用还需过滤,加入反应管前需要升至室温,否则虽不影响精度,但测得的OD值较低,对仪器要求较高。

标准牛血清白蛋白(BSA):精确称取4mg BSA粉末,溶于1mL 0.15mol/L NaCl溶液配制成4mg/mL标准蛋白溶液,-20℃保存。(如用1cm比色皿测定,建议精确称取40mg BSA粉末,溶于10mL 0.15mol/L NaCl溶液配制成4mg/mL标准蛋白溶液,分装成小管,-20℃保存。)

稀释溶液:一般为消除误差,稀释溶液为待测定蛋白的提取缓冲液,或为简便处理,可用双蒸灭菌水、PBS溶液、0.9%生理盐水(0.15mol/L NaCl)


主要设备

Biotek酶标仪,移液枪,96孔酶标板

实验材料

标准牛血清白蛋白(BSA),待测蛋白溶液(浓度稀释至标准曲线范围内)

实验步骤


1.标准方案(50~4000ug/mL)标准曲线的BSA蛋白倍比稀释

标准测定(比色皿)测定:

于200uL微量离心管中,取30uL,4000ug/mL BSA加入到30uL稀释溶液中,得到2000ug/mL BSA标准溶液;继续取取30uL,2000ug/mL BSA加入到30uL稀释溶液中,得到1000ug/mL BSA标准溶液;取30uL连续倍比稀释6次,就可以得到2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ug/mL BSA标准溶液。每一稀释度标准溶液各取20uL,与1980uL(为简便操作,取2000uL)考马斯亮蓝G-250染色工作液在?mL离心管中混合均匀,室温放置 2分钟,置于分光光度计测定OD595值。

微量(微孔板)测定:

于96孔板中,取5uL,4000ug/mL BSA加入到5uL稀释溶液中,得到2000ug/mL BSA标准溶液;继续取取5uL,2000ug/mL BSA加入到5uL稀释溶液中,得到1000ug/mL BSA标准溶液;取5uL连续倍比稀释6次,就可以得到2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ug/mL BSA标准溶液。每一稀释度标准溶液各取3uL,与297uL(为简便操作,可取300uL)考马斯亮蓝G-250染色工作液在200uL微量离心管中混合均匀,室温放置 2 分钟,置于酶标仪中测定OD595值。

以标准蛋白浓度(ug/mL)为横坐标,以OD595吸光值为横坐标作图,即为标准曲线。

 

2.样品测定与浓度计算

取样品20uL(比色皿测定法)或3uL(微孔板测定法)与2000uL(比色皿测定法)或300uL(微孔板测定法)考马斯亮蓝G-250染色工作液混合均匀,室温放置 2 分钟,置于分光光度计(酶标仪)中测定OD595值。根据样品OD595值和标准曲线,查出未知样品的蛋白浓度。如果样品在与考马斯亮蓝G-250染色工作液混合之前经过稀释,最后计算样品蛋白浓度时须乘以实际稀释倍数。


注意事项


1. 当吸光度大于 0.8A 时,请把样本稀释后再测定。样品稀释浓度最好在标准曲线范围之间。

2. Bradford 法测定蛋白浓度时待测样品浓度在 1~1500 ug/mL浓度范围内有较好的线性关系。 您也可以根据需要调整标准蛋白稀释浓度范围来绘制标准曲线,以便得到更精确的结果。

3. 最好使用塑料或玻璃比色皿。染料-蛋白结合物附着在石英比色皿后难以洗去,因此不宜使用石英比色皿。如使用石英比色皿,使用后立即用少量 95%的乙醇荡洗,以洗去染色。用完后可以乙醇反复清洗。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

4. 比色顺序从蛋白浓度低的管开始,中间不必清洗比色皿,以免影响结果。

5. 疏水蛋白或粘蛋白,可能与染料发生沉淀,加入等体积 1N NaOH 可以消除。

6. 如果知道样品的蛋白大体浓度,可以采用相近的 3 管做标准曲线。

7. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。小于3kD短肽纯品不能用此方法测定。

8. Bradford 染色液含有刺激性或者腐蚀性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。

9. Bradford 染色液中考马斯亮蓝易聚集成团,每次使用前请颠倒6~8 次并且竖直抓住瓶口做水平圈动作,旋转瓶中液体,帮助充分混匀,但不可以上下振荡混匀。

10. 低温会降低 Bradford 染色液的敏感度,因此每次使用前应该使Bradford 染色液回复到室温,可以倒出每次需要的 Bradford 染色液,将原瓶放回冰箱,仅仅将需要的Bradford 染色液复温,可以减少复温时间。

11.蛋白-染料结合物在1小时内保持稳定,但在5~20分钟内稳定性最好,因此应尽快测定。如果放置过久将出现沉淀,或使测定结果偏低。

12.可以考虑分别在工作波长为595nm或450nm测定OD值,计算OD595/OD450,以此代替原有的OD595作图,可明显提高检测的精确度和灵敏度10倍,显著提高测定的线性关系,并降低去垢剂的影响。在进行超敏感度测定时可考虑此法。

13. 标准品曲线配制时,如果吸量不准确或者加样枪不精确会造成标准曲线相关系数减小,可根据需要使用倍比梯度稀释的方法来配制,或者使用精确度高的加样枪。

14. 由于 Bradford 法在蛋白浓度增高到一定时候,颜色反应并不成比例增加,因此得到的标准曲线只是在一定范围内可以近似看成直线,每次应按照实际测得的标准曲线计算出相对精确的蛋白浓度。

15. 需要酶标仪一台,最佳检测波长为 595nm,也可以在570~610nm 之间波长测定,但会降低一些灵敏度。并需96 孔板。如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定。使用分光光度计测定蛋白浓度时,每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。

16. 不像其它一些蛋白浓度测定方法(包括 Lowry 法), Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中巯基乙醇的浓度可高达1M,二流苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS 低于0.125%,Triton X-100 低于0.125%, Tween 20低于0.06%,可以考虑用超纯水稀释,透析/除盐, ACETONE/TCA 沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。 含去垢剂的样品推荐使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒。


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