实验概要
Bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。Coomassie brilliant blue G-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。灵敏度比Lowry法高4倍，与BCA法相当。反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。操作简便，只需要一种反应试剂。
实验原理
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
主要试剂
考马斯亮蓝G-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝G-250粉末溶于5mL 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10mL 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（H3PO4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5mL移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100mL。后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的OD值较低，对仪器要求较高。
标准牛血清白蛋白（BSA）：精确称取4mg BSA粉末，溶于1mL 0.15mol/L NaCl溶液配制成4mg/mL标准蛋白溶液，-20℃保存。（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg BSA粉末，溶于10mL 0.15mol/L NaCl溶液配制成4mg/mL标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。）
稀释溶液：一般为消除误差，稀释溶液为待测定蛋白的提取缓冲液，或为简便处理，可用双蒸灭菌水、PBS溶液、0.9%生理盐水（0.15mol/L NaCl）
主要设备
Biotek酶标仪，移液枪，96孔酶标板
实验材料
标准牛血清白蛋白（BSA），待测蛋白溶液（浓度稀释至标准曲线范围内）
实验步骤
1.标准方案（50~4000ug/mL）标准曲线的BSA蛋白倍比稀释
标准测定（比色皿）测定：
于200uL微量离心管中，取30uL，4000ug/mL BSA加入到30uL稀释溶液中，得到2000ug/mL BSA标准溶液；继续取取30uL，2000ug/mL BSA加入到30uL稀释溶液中，得到1000ug/mL BSA标准溶液；取30uL连续倍比稀释6次，就可以得到2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ug/mL BSA标准溶液。每一稀释度标准溶液各取20uL，与1980uL（为简便操作，取2000uL）考马斯亮蓝G-250染色工作液在？mL离心管中混合均匀，室温放置 2分钟，置于分光光度计测定OD595值。
微量（微孔板）测定：
于96孔板中，取5uL，4000ug/mL BSA加入到5uL稀释溶液中，得到2000ug/mL BSA标准溶液；继续取取5uL，2000ug/mL BSA加入到5uL稀释溶液中，得到1000ug/mL BSA标准溶液；取5uL连续倍比稀释6次，就可以得到2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ug/mL BSA标准溶液。每一稀释度标准溶液各取3uL，与297uL（为简便操作，可取300uL）考马斯亮蓝G-250染色工作液在200uL微量离心管中混合均匀，室温放置 2 分钟，置于酶标仪中测定OD595值。
以标准蛋白浓度（ug/mL）为横坐标，以OD595吸光值为横坐标作图，即为标准曲线。
2.样品测定与浓度计算
取样品20uL（比色皿测定法）或3uL（微孔板测定法）与2000uL（比色皿测定法）或300uL（微孔板测定法）考马斯亮蓝G-250染色工作液混合均匀，室温放置 2 分钟，置于分光光度计（酶标仪）中测定OD595值。根据样品OD595值和标准曲线，查出未知样品的蛋白浓度。如果样品在与考马斯亮蓝G-250染色工作液混合之前经过稀释，最后计算样品蛋白浓度时须乘以实际稀释倍数。
注意事项
1. 当吸光度大于 0.8A 时，请把样本稀释后再测定。样品稀释浓度最好在标准曲线范围之间。
2. Bradford 法测定蛋白浓度时待测样品浓度在 1～1500 ug/mL浓度范围内有较好的线性关系。 您也可以根据需要调整标准蛋白稀释浓度范围来绘制标准曲线，以便得到更精确的结果。
3. 最好使用塑料或玻璃比色皿。染料-蛋白结合物附着在石英比色皿后难以洗去，因此不宜使用石英比色皿。如使用石英比色皿，使用后立即用少量 95%的乙醇荡洗，以洗去染色。用完后可以乙醇反复清洗。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
4. 比色顺序从蛋白浓度低的管开始，中间不必清洗比色皿，以免影响结果。
5. 疏水蛋白或粘蛋白，可能与染料发生沉淀，加入等体积 1N NaOH 可以消除。
6. 如果知道样品的蛋白大体浓度，可以采用相近的 3 管做标准曲线。
7. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。小于3kD短肽纯品不能用此方法测定。
8. Bradford 染色液含有刺激性或者腐蚀性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
9. Bradford 染色液中考马斯亮蓝易聚集成团，每次使用前请颠倒6～8 次并且竖直抓住瓶口做水平圈动作，旋转瓶中液体，帮助充分混匀，但不可以上下振荡混匀。
10. 低温会降低 Bradford 染色液的敏感度，因此每次使用前应该使Bradford 染色液回复到室温，可以倒出每次需要的 Bradford 染色液，将原瓶放回冰箱，仅仅将需要的Bradford 染色液复温，可以减少复温时间。
11.蛋白-染料结合物在1小时内保持稳定，但在5~20分钟内稳定性最好，因此应尽快测定。如果放置过久将出现沉淀，或使测定结果偏低。
12.可以考虑分别在工作波长为595nm或450nm测定OD值，计算OD595/OD450，以此代替原有的OD595作图，可明显提高检测的精确度和灵敏度10倍，显著提高测定的线性关系，并降低去垢剂的影响。在进行超敏感度测定时可考虑此法。
13. 标准品曲线配制时，如果吸量不准确或者加样枪不精确会造成标准曲线相关系数减小，可根据需要使用倍比梯度稀释的方法来配制，或者使用精确度高的加样枪。
14. 由于 Bradford 法在蛋白浓度增高到一定时候，颜色反应并不成比例增加，因此得到的标准曲线只是在一定范围内可以近似看成直线，每次应按照实际测得的标准曲线计算出相对精确的蛋白浓度。
15. 需要酶标仪一台，最佳检测波长为 595nm，也可以在570～610nm 之间波长测定，但会降低一些灵敏度。并需96 孔板。如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
16. 不像其它一些蛋白浓度测定方法（包括 Lowry 法）， Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二流苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS 低于0.125%,Triton X-100 低于0.125%， Tween 20低于0.06%，可以考虑用超纯水稀释，透析/除盐， ACETONE/TCA 沉淀蛋白后重溶于超纯水等方法来消除干扰物质的影响。 含去垢剂的样品推荐使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒。
