实验概要
1.目的 检测小分子蛋白抗体
2.适用范围 单克隆抗体和多克隆抗体
实验原理
将经电泳分离的抗原转印到膜上作为固相,利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体
主要试剂
试剂配制
4.1.1 40% Bis-acrylamide with 2.6% C （Acrylamide:Bis, 38.95:1.05）
丙烯酰胺 77.9g
双甲叉丙烯酰胺 2.1g
Total 200ml
4.1.2 30%胶溶液:
0.8 双甲叉丙烯酰胺 0.8g
29.2% 丙烯酰胺 29.2g
total 100ml
4.1.3 3M TrisHCl , pH 8.45
36.3g Trisbase
Total 100ml
4.1.4 WG ( water Glycerol):
Water: 58ml
Glycerol: 36ml
Total: 94ml
4.1.5 10x Electrophoresis Buffer stock pH8.3 （to make the working buffer, just dilute 10 times. Do not adjust pH , pH should be 8.3.）
Trisbase 60.5g
Tricine 89.5g
SDS 5g
total 500ml
4.1.6 10% SDS
SDS 10g
Total 100ml
4.1.7 2x Laemmli Stacking Buffer pH6.8:
0.25M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS
total 500ml
4.1.8 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:
Stock: to use:
20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock
10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml
250mM Tris 15.14g bromphenol blue or
total 475.00ml pyronine 4 to taste
4.1.9 transfer buffer
48mM Tris base 5.81g
39mM Glycine 2.93g
0.037% SDS 0.375g or 1.875ml of 20% SDS
40% MeOH 400ml
total 1000ml
4.1.10 TBST
10mM Tris-HCl, pH7.4
100mM NaCl
0.2% Tween-20
Total 1000ml
4.1.11 稀释液 TBST 5% 脱脂奶粉
4.1.12 ECL底物溶液 A液1ml B液1ml，临用时配制
4.1.13 DAB底物溶液
DAB(3,3二氨基联苯胺) 50mg
0.05mol/L Tris-Base（PH7.6） 100ml
先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，使用稀释，临用时加入30%H2O2，在工作液中终浓度0.01％
4.1.14 PSQ膜
4.1.15 甲醇
4.1.16 显影液
4.1.17 定影液
4.1.18 X光胶片
主要设备
电泳仪
实验材料
分离胶、间隙胶及浓缩胶配方比例
分离胶配方： 15%
Separating Gel (15%) | 1块胶 |
WG | 1.88ml |
40％ Gel.sol | 2 ml |
3M TrisHCl pH 8.45 | 2 ml |
10% SDS | 0.06 ml |
10%APS | 0.06 ml |
TEMED | 0.003 ml |
Total | 6.003 ml |
间隙胶配方： 10%
Spacer Gel (10%) | 1块胶 |
dH2O | 0.47 ml |
30％ Gel.sol | 0.5 ml |
3M TrisHCl pH 8.45 | 0.5 ml |
10% SDS | 0.015 ml |
10%APS | 0.015 ml |
TEMED | 0.0015 ml |
Total | 1.5015 ml |
浓缩胶配方：4%
Stacking Gel (4%) | 1块胶 |
2×Stacking. buffer | 1.5ml |
30％ Gel.sol | 0.75ml |
ddH2O | 0.75ml |
TEMED | 4ul |
10%APS | 40ul |
Total | 3.44ml |
感谢您对labfere的关注，祝您实验顺利
实验步骤
操作步骤
4.2.1 Tricine-SDS-PAGE（分离胶、间隙胶、浓缩胶配方参见附录）
4.2.1.1 做分离胶，加水封胶，待其凝固。
4.2.1.2 做间隙胶，加水封胶，待其凝固。
4.2.1.3 做浓缩胶，插梳子。
4.2.1.4 待浓缩胶凝固后，拔掉梳子，并将架子转移到电泳槽中，先在中部加入1x Electrophoresis Buffer pH8.3，点样。
4.2.1.5 调节电压到60v,开始电泳，一小时后电压升至120v。
4.2.1.6 溴酚蓝开始跑出最下端时停止电泳
4.2.2电转印
4.2.2.1 将PSQ膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再用transfer buffer浸泡，同时将滤纸浸泡入transfer buffer 中.
4.2.2.2 转移。在电转移仪上铺好滤纸，膜和胶，如图。滤纸一般用三层，滤纸和膜、膜 和胶之间一定不能有气泡。装好电转移仪, 根据需要选定所需的电流。转移时间一般为2.5 小时,( 1mA-2mA/cm2, 10% gel), 可根据分子量大小调整转移时间和电流大小.转移过程中随时观察电压的变化,如有异常应及时调整
4.2.3 免疫印迹
4.2.3.1 转移结束后，将膜放入稀释液中封闭，4℃孵育16小时 或 室温孵育1小时
4.2.3.2 按需求稀释一抗，加在膜上相应的位置，室温 孵育1小时
4.2.3.3 用 TBST洗三次,每次5min
4.2.3.4 加酶标二抗，室温孵育1 小时. 一般采用HRP标记的二抗, 稀释比例为1:5000（参考：一张膜，10ml 牛奶 2ul二抗，两张膜，20 ml 牛奶4ul二抗）
4.2.3.5 用TBST洗三次,每次5min
4.2.3.6 显影。在暗室里，将PSQ膜泡在ECL底物溶液1分钟左右(一般每张膜,用1.6ml-2.0ml的反应底物)，然后用保鲜膜将PSQ膜包好，放入暗盒；关掉日光灯，打开红外灯，取出胶片，折左上角作记号，铺到膜上，夹好暗盒；1分钟后取出胶片，放入显影液中，轻轻振荡，3分钟后取出，清水洗涤一次，放入定影液中，轻轻振荡，3分钟后观察结果，并根据第一张的曝光情况，调整下面胶片的曝光时间和曝光区域
4.2.3.7显影完后收拾好暗室的物品，带胶片离开
4.2.3.8 也可用DAB底物溶液显色
