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小分子蛋白Western blot 检测

实验概要


1.目的  检测小分子蛋白抗体

2.适用范围  单克隆抗体和多克隆抗体


实验原理

将经电泳分离的抗原转印到膜上作为固相,利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体



主要试剂


试剂配制

4.1.1  40% Bis-acrylamide with 2.6% C (Acrylamide:Bis, 38.95:1.05)

      丙烯酰胺         77.9g

      双甲叉丙烯酰胺   2.1g

      Total             200ml

4.1.2  30%胶溶液:

0.8    双甲叉丙烯酰胺    0.8g

29.2% 丙烯酰胺          29.2g

        total             100ml

4.1.3  3M TrisHCl , pH 8.45

      36.3g    Trisbase  

      Total    100ml

4.1.4   WG ( water   Glycerol):   

       Water:     58ml

       Glycerol:   36ml

       Total:      94ml

4.1.5    10x Electrophoresis Buffer stock pH8.3 (to make the working buffer, just dilute 10 times. Do not adjust pH , pH should be 8.3.)

Trisbase       60.5g

Tricine        89.5g

SDS          5g

          total          500ml

4.1.6   10% SDS

        SDS    10g

        Total    100ml

4.1.7    2x Laemmli Stacking Buffer pH6.8:

0.25M Tris       15.14g

0.2% SDS        1g or 5ml 20% SDS

          total         500ml

4.1.8  5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:

Stock:                                    to use:

20% Glycerol      100ml                  take 9.5ml stock        

10% SDS         50g or 250ml 20% SDS    add BME 0.5ml

250mM Tris       15.14g                  bromphenol blue or 

          total           475.00ml                pyronine 4 to taste

4.1.9  transfer buffer                      

48mM Tris base      5.81g

39mM Glycine       2.93g

0.037% SDS         0.375g or 1.875ml of 20% SDS

40% MeOH          400ml

total           1000ml

 

4.1.10  TBST

10mM Tris-HCl, pH7.4

100mM NaCl

0.2% Tween-20

         Total  1000ml

4.1.11 稀释液  TBST  5% 脱脂奶粉

4.1.12  ECL底物溶液  A液1ml   B液1ml,临用时配制

4.1.13  DAB底物溶液

DAB(3,3二氨基联苯胺)         50mg

0.05mol/L Tris-Base(PH7.6)    100ml

先配成2-5倍的储存液,过滤后分装,-20℃避光保存,使用稀释,临用时加入30%H2O2,在工作液中终浓度0.01%

4.1.14  PSQ膜

4.1.15  甲醇

4.1.16  显影液

4.1.17  定影液

4.1.18  X光胶片



主要设备

电泳仪



实验材料


分离胶、间隙胶及浓缩胶配方比例

 

分离胶配方: 15% 

Separating Gel (15%)

1块胶

WG

1.88ml

40% Gel.sol

2 ml

3M TrisHCl  pH 8.45

2 ml

10% SDS

0.06 ml

10%APS

0.06 ml

TEMED

0.003 ml

Total

6.003 ml

 

间隙胶配方: 10% 

Spacer Gel (10%)

1块胶

dH2O 

0.47 ml

30% Gel.sol

0.5 ml

3M TrisHCl  pH 8.45

0.5 ml

10% SDS

0.015 ml

10%APS

0.015 ml

TEMED

0.0015 ml

Total

1.5015 ml

 

浓缩胶配方:4% 

Stacking Gel (4%)

1块胶

2×Stacking. buffer

1.5ml

30% Gel.sol

0.75ml

ddH2O

0.75ml

TEMED

4ul

10%APS

40ul

Total

3.44ml

 

感谢您对labfere的关注,祝您实验顺利


实验步骤


操作步骤

4.2.1   Tricine-SDS-PAGE(分离胶、间隙胶、浓缩胶配方参见附录)

4.2.1.1  做分离胶,加水封胶,待其凝固。

4.2.1.2  做间隙胶,加水封胶,待其凝固。
4.2.1.3  做浓缩胶,插梳子。

4.2.1.4  待浓缩胶凝固后,拔掉梳子,并将架子转移到电泳槽中,先在中部加入1x Electrophoresis Buffer  pH8.3,点样。
4.2.1.5  调节电压到60v,开始电泳,一小时后电压升至120v。 
4.2.1.6  溴酚蓝开始跑出最下端时停止电泳

4.2.2电转印
4.2.2.1  将PSQ膜泡入甲醇中,约1-2分钟。再用transfer buffer浸泡,同时将滤纸浸泡入transfer buffer 中. 

4.2.2.2  转移。在电转移仪上铺好滤纸,膜和胶,如图。滤纸一般用三层,滤纸和膜、膜 和胶之间一定不能有气泡。装好电转移仪, 根据需要选定所需的电流。转移时间一般为2.5 小时,( 1mA-2mA/cm2, 10% gel), 可根据分子量大小调整转移时间和电流大小.转移过程中随时观察电压的变化,如有异常应及时调整

4.2.3  免疫印迹

4.2.3.1  转移结束后,将膜放入稀释液中封闭,4℃孵育16小时 或 室温孵育1小时

4.2.3.2  按需求稀释一抗,加在膜上相应的位置,室温 孵育1小时

4.2.3.3  用 TBST洗三次,每次5min

4.2.3.4 加酶标二抗,室温孵育1 小时. 一般采用HRP标记的二抗, 稀释比例为1:5000(参考:一张膜,10ml  牛奶 2ul二抗,两张膜,20 ml 牛奶4ul二抗)

4.2.3.5 用TBST洗三次,每次5min

4.2.3.6 显影。在暗室里,将PSQ膜泡在ECL底物溶液1分钟左右(一般每张膜,用1.6ml-2.0ml的反应底物),然后用保鲜膜将PSQ膜包好,放入暗盒;关掉日光灯,打开红外灯,取出胶片,折左上角作记号,铺到膜上,夹好暗盒;1分钟后取出胶片,放入显影液中,轻轻振荡,3分钟后取出,清水洗涤一次,放入定影液中,轻轻振荡,3分钟后观察结果,并根据第一张的曝光情况,调整下面胶片的曝光时间和曝光区域

4.2.3.7显影完后收拾好暗室的物品,带胶片离开

4.2.3.8  也可用DAB底物溶液显色


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