荧光定量PCR系统知识汇总

Q1：什么是荧光定量PCR？

答：指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个
PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。

Q2：定量PCR原理？

答：与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行；理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍；每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号；在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强。

Q3：定量PCR体系？

答：普通的PCR体系；模板,引物,dNTPs，buffer，Taq酶；加入各种类型的荧光染料。

在做Real time PCR时，对于SYBR Green I染料法和Taqman探针法都可以，但是二者有区别。SYBR Green I染料法是利用SYBR Green I结合双链DNA来检测PCR产物，可用于监测任意双链DNA序列的扩增，但是必须考虑非特异性扩增。因成本相对低，是目前较常用的(看来大家都穷，哈哈)。但是由于SYBRGreen I可以与所有的双链DNA结合，包括非特异性的双链DNA序列，因此可能会产生假阳性信号。

Taqman探针法使用荧光探针检测PCR扩增过程中产生的特异PCR产物：特异性荧光信号的产生，需要探针与目标序列进行特异性的杂交；探针可以标记不同的报告基团，因此可以在一个反应管中进行二条序列扩增完整的探针。5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移)；退火，探针与模板结合，引物在聚合酶作用下进行延伸反应，遇到探针时发挥3′-5′外切酶活性将探针切碎到反应体系中；报告基团与淬灭基团距离变大，在激发光的作用下发荧光。实验结果重复性好，价格高，土豪课题组强烈建议用这个。

Q4：典型的PCR四阶段？

答：PCR存在典型的4个阶段，分别是基线期，指数增长期，线性增长期和平台期。

PS：基线就是背景值，也就是曲线在没有起飞之前的一段。一般在PCR程序软件上有一个地方可以输入baseline从第几到第几 cycle 作为基线。设置原则是使没有起跳之前最多的 cycle 的信号接近 0。

下图更清晰！

Q5：什么是阈值？

答：高于背景荧光强度的值被确定为阈值；控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉点确定CT值。

Q6：CT值的含义是什么？

答：C代表Cycle，T代表阈值(threshold)。CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。其中蕴含的数学关系：Log浓度与Ct呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。

Q7：溶解曲线 derivative view啥意思，有什么用？

答：反映结束后，温度逐步提升，双链产物在某一温度区域变性为单链，双链结合染料脱离出来，成为不发荧光的游离态。这一过程检测到的荧光值迅速降低，其监测值曲线即溶解曲线，不同产物的因其不同Tm值，会产生不同的溶解曲线峰。(关于各种曲线的解读，可参看往期内容)

Q8：PCR开始前的注意事项？

答：需要做ROI(Regions of Interest)校正；需要做背景校正，即检测PCR仪的环境荧光强度，尤其注意检测加热槽是否存在污染，若有则必须乙醇及去离子水反复清洗反应孔，直至确认无残留。

Q9：RNA提取方法？

答：RNA提取方法有多种。有机溶剂法，该法提取的样本纯度高，但是劳动强度大(小编心生感慨，为什么劳动强度大的方法总是最常用的方法)。过柱法：方便快捷，提取效率高，适用范围广，但是偏贵。磁珠法的产量很高，并且洗脱体积小，不用离心，适合高通量提取，也贵(哎！)。

道路千万条，快速第一条。一旦细胞死亡或者相关样本离开机体，很快就会被RNases酶降解，做芯片的朋友尤其得注意了。

Q10：目标样品用量 ？

答：DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6-2.0之间；DNA用量：0.1ng-100ng 。

RNA纯度：OD260/OD280=2.0；cDNA用量：10-100ng。

Q11：标准品的注意事项？

答：标准品是用来生成标准曲线，并建立CT值与浓度之间的数学关系。浓度已知，Ct值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间制备至少5个点的10倍标准曲线(4 logs)，PCR效率一致，且接近100% ，与未知样本实验条件平行，每个点至少要做3次重复。不要求标准品与目标基因使用相同的DNA。

1. R2≥0.99；

2. Eff%=90%-110%

3. Slope=-3.58~-3.10。

理想的斜率=-3.32(对应100%扩增效率)；效率在90%-110%(斜率为-3.58到-3.10之间)都表示扩增较好 。

Q12：相对定量的含义和数据处理方法？

答：相对定量相对定量一般采用ΔΔCT法。

Q13：扩增效率达不到 100% 的原因有哪些？

答：比较Ct值的前提是每经过1个循环，产物的量会加倍在这种情况下，反应的扩增效率为100%。如果扩增效率下降，其中的数学关系不再成立，比较Ct值就没有意义。

导致扩增效率达不到 100% 的原因一般有以下这些：

1. 实验组分的浓度及质量。如果样品包含PCR抑制剂，反应会减慢，甚至不反应。这种情况常见于来自生物制品样本的核酸。cDNA作为起始模板时很少见；

2. 扩增产物太长实时定量PCR检测建议扩增产物序列长度为50-150碱基；

3. 没有选择合适的引物退火温度；

4. 设计的引物有错配 ；

5. 模板序列特殊(比如：GC含量高)；

6. 二级结构的影响(引物、探针、扩增产物)。

Q14：无扩增曲线是怎么回事？

答：分分两大类来说。

1.通过电泳检测无条带，也无扩增曲线。a.引物设计问题；b.引物质量问题；c.扩增体系问题；d.退火温度问题。

2.电泳检测有条带，但无扩增曲线。a.程序设定问题或仪器出现故障；b.探针合成问题；c.探针淬 。

3.此外模板不足或者模板降解也需要注意。

Q15：扩增曲线不柔顺怎么回事？
答：请使用海飞丝(手动狗头)。

正经说。

1.探针与模板结合不稳定(曲线不平且荧光值低)。a.原始序列不准确或有SNP，导致探针不宜结合；b.将文献中的MGB探针序列直接合成taqman探针，退火温度过低。

2.仪器或试剂问题，可参考平行内参阳性对照扩增曲线。

3.罗氏lightcycler1.0或2.0要在体系中加BSA封闭。

4.调整探针或染料浓度。

Q16：出现斜线型曲线怎么回事？

答：探针降解(本底荧光值高)，可以使用变性PAGE胶检测是否降解；体系中含有抑制成分。

Q17：Sybergreen法在35个循环之后阴性对照起飞了？

答：体系中组份的非特异扩增，引物二聚体的自我延伸。

Q18：溶解曲线出现多个峰？

答：1. 引物非特异扩增。2. 引物二聚体。3. 基因组DNA污染：在检测cDNA的时候，同时扩增出含有内含子的较长的基因组上的片段。其中第一条是最常见的原因，因此在设计引物时，至少有一条跨过两个外显子的接合处，使其无法与含有内含子的基因组DNA结合。

Q19：ROX染料是什么作用？

答：ROX用于荧光-校准物理误差。Master Mix中ROX浓度固定。ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关。ROX的功能：耗材质量(如管盖厚度、透光性能)、仪器稳定性(如孔间、批间波动)等的误差，反应体系监控(蒸发)

校正方式：Rn=RReporter / RROX。即需要把这个差异用 ROX 来计算孔间差异有多大，然后差异系数去处理，实际的荧光信号。

Q20：PCR各组注意事项？

答：注意事项太多了，仅列举常见的。

• 实验室分区：样品处理区、PCR反应制备区、扩增区；

• 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器；

• 标准品的稀释液中最好含有Carrier RNA；

• 移液器使用带滤芯的吸头；

• 先阴性对照样，后加样品，再加低浓度标准品，最后加阳性对照；

• PCR管上不可用记号笔标记；

• PCR管使用平盖或光膜，不要裸手触摸光盖或光膜表面；

• PCR管或8联排管要对称放置；

• 反应后的PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启；

• 采用UNG防污染系统，消除前次扩增产物的污染影响。