GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。

其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽标记的磁珠上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液与之孵育,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。

GST-pull down技术是在GST融合蛋白的基础上发展起来的，GST 能与谷胱甘肽特异性结合，其作为表达标签蛋白，能促进原核表达蛋白的正确折叠及可溶性表达。GST-pull down 主要包括以下 3 部分：

① 用基因重组技术构建带有 GST 标签的原核表达载体；
② 通过原核表达系统表达带有 GST 标签的融合蛋白；
③ 利用 GST 亲和纯化柱进行蛋白纯化，获得高纯度的融合蛋白；再利用 GST 亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。

具体原理见图 1

图 1 GST-pull down 的原理

注：

①获得带有 GST 标签的融合蛋白；
②将带有 GST 标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层析柱上；
③获取可能与融合蛋白发生相互作用的蛋白；
④与融合蛋白发生相互作用的蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上；
⑤切掉标签，洗脱得到相互作用的蛋白。

实验概要

体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理

利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

主要试剂

NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160）

实验步骤

1. 原核融合蛋白A的获得

1) 将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株

2) 挑取单个克隆到含有5mlLB( 100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜

3) 将培养菌液转移到含有500ml LB( 100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N

4) 室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS 1%Triton-100 PMSF），吹打混匀

5) 冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉

6) 11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清， -80℃保存备用

2. 真核融合蛋白B的获得

1) 将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染

3. 48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融

4. 取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS 1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。

5. PBS 1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS Beads）作Offer。

6. 同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS 1%Triton-100 Cocktaier），4℃放置30分钟。

7. 吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。

8. BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合O/N

9. PBS 1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。

10. 40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run –SDS PAGE做Western Blot检测。用HA或者myc Blot。