蛋白质的提取
▶ 提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。
▶ 蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。
▶ 蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。
提高跑胶质量的Tips
▶ 小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。
▶ 胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。
内参的选择
▶ 做全细胞和细胞质的WB实验时，选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时，由于Histone H3是染色体的组成型表达组分，表达相当稳定，并且特别好跑，可以算是细胞核内参的首选。
▶ 针对一些特定的内参，蛋白上样量超过一定的量时，出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin，当上样量超过20 μg时，条带灰度不会呈线性的增加。因此，在做WB校正时，调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。
WB结果中背景较高
▶ 膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液
▶ 一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度，或者是 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。
▶ 膜的选择有问题：选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点，膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。
▶ 检测时曝光时间过长，可减少曝光时间
WB结果信号弱或无信号
每个做WB的科研人的终极噩梦 —— 白板
图片来源：丁香园论坛上的网友
▶ 你所检测的样本中有不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，检测样本低表达目的蛋白，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
▶ 提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。抑制剂）。
▶ 一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜，或者是由于二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。
▶ 洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
