科研星球

注意!WB实验中最容易被忽视的关键细节

蛋白质的提取

▶ 提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶抑制剂)。

▶ 蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存,不要反复冻融。

▶ 蛋白浓度低时,可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。


提高跑胶质量的Tips

▶ 小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55V,分离胶75V就能跑得很好,但是实验的时间会很长。

▶ 胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀(不要有气泡),玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶。


内参的选择

▶ 做全细胞和细胞质的WB实验时,选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时,由于Histone H3是染色体的组成型表达组分,表达相当稳定,并且特别好跑,可以算是细胞核内参的首选。

▶ 针对一些特定的内参,蛋白上样量超过一定的量时,出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin,当上样量超过20 μg时,条带灰度不会呈线性的增加。因此,在做WB校正时,调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。


WB结果中背景较高

▶ 膜封闭不够,建议延长封闭的时间;选择合适的封闭液

▶ 一抗稀释度不适宜,太高,选择最适宜的抗体稀释度,或者是 一抗孵育的温度偏高,建议4℃过夜孵育。

▶ 膜的选择有问题:选择的膜容易产生高背景,一般NC膜的背景会比PVDF膜低,但是NC膜吸附力也就差了一点,膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过,实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。

▶ 检测时曝光时间过长,可减少曝光时间



WB结果信号弱或无信号

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每个做WB的科研人的终极噩梦 —— 白板

图片来源:丁香园论坛上的网友


▶ 你所检测的样本中有不表达目的蛋白,选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性,检测样本低表达目的蛋白,提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

▶ 提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。抑制剂)。

▶ 一抗孵育时间不足,建议4℃结合过夜,或者是由于二抗与一抗不匹配,选择针对一抗来源的种属的抗体。

▶ 洗膜过度,洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。


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