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免疫荧光最全攻略:从protocol到问题解决方案汇总

免疫荧光(Immunofluorescence):简称IF,与western blotting一样,也是根据抗原抗体反应的原理,将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上,与其相应的抗原或抗体结合后,在荧光显微镜下进行观察,从而确定抗原或抗体的性质和定位,包括直接法和间接法。

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实验步骤

 

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1. 样品准备(贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等)


(1)对于贴壁细胞: 

先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理,然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中,用无菌 PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片,操作小心,防止细胞脱片。

(2)对于悬浮细胞:有2种方法,

①先在悬浮液中进行固定步骤,然后把细胞滴加在载玻片上,干燥后细胞会紧贴在载玻片上。

②先在悬浮液中进行固定和染色步骤,离心洗脱,然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。

(3)对于冷冻切片:切片放置在载玻片上后,可以直接进行固定等后续操作。 

(4)对于石蜡切片:免疫荧光中石蜡切片较少,要先进行脱蜡和抗原修复处理。 


2、 固定(防止离体组织自溶抗原扩散)

固定液包括:有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等);交联剂(4%PFA、10%中性福尔马林),固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性,不过,目前甲醛用的还是最多的,但针对磷酸化的抗体,不适合用甲醛,会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中,故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇,同时应注意甲醛会挥发,在4-8°C不宜储存太久。


固定时间:取决于组合块的大小和类型,对于大多数组织,18-24h较为理想,细胞固定时间较短,一般2%的甲醛室温固定20min即可。


以细胞样品为例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min。


3、通透(目的是使抗体进入胞内)

0.5%Triton X-100( 一种去垢剂,用PBS配制 )室温通透20min(针对胞内抗原,若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤);除了Triton X-100,丙酮也可作为通透剂,并且丙酮固定后的样品不需要通透。


4、封闭(减少一抗和二抗与非特异位点进行结合)

通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室温封闭30min。常用的封闭液包括:与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。


5、一抗孵育

根据一抗的说明书,按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗,用吸水纸吸尽封闭液,每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒, 4℃孵育过夜。回收一抗,加入PBST, 在摇床上缓慢摇动洗涤5min,共洗涤3次


6、荧光二抗孵育

用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中孵育1h后,回收二抗,接着用PBST洗3次,每次5min;由于荧光容易淬灭,故从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都要避光。   


7、复染核(定位的关键)

在玻片上滴加DAPI,并注意避光孵育5min,对标本进行染核,然后用PBST洗3次,每次5min,洗去多余的DAPI;


8、封片及荧光观察:用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察。




常见问题


1、弱荧光信号


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可能问题

解决方法

错误的激发波长

确保激发波长与荧光基团激发光波长相匹配

不兼容的一抗或二抗

注意种属问题

固定过度或不充分

适当调整时间

样本保存不当

注意避光

一抗不好用

建议做阳性对照确认抗体的有效性


2、高背景

 

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可能问题

解决方法

洗涤不足

充分洗涤,适当增加洗涤次数

样本干燥

在湿盒中孵育抗体,避免样本干燥

封闭不充分

延长时间或更换封闭液

抗体浓度过高

预实验滴定,确认最佳浓度

二抗非特异性结合

不加一抗,只加二抗,作对照

样本自发荧光

提前检测样本自发荧光情况


3、细胞/组织形态被破坏

 

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可能问题

解决方法

组织切片从玻片上脱落或切片有气泡

适当增加固定时间

组织切片撕裂或有褶皱

切割刀片不太锋利,考虑重新切片

细胞或组织固定不充分,自发裂解

适当增加固定时间,使用交联性固定剂


三、注意事项:对照实验的设置


1、 内源性组织背景对照:某些细胞和组织可能有固有的生物学性质,会产生背景荧光,对结果产生影响,例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前,应对样品进行观察,确保抗原本身没有信号。

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2、阳性对照:用确认含有待测抗原的组织或细胞,与待测标本进行统一处理,结果应为阳性,可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。

3、阴性对照:与阳性对照相反,用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色,结果若为阴性,可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。

IF 常见问题及优化方案


问题可能原因优化方案
信号弱或无信号目标蛋白在细胞中没有表达制备细胞裂解液,用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达
染色细胞过少
表达目标蛋白的细胞过少

标本中使用更多的细胞,试用其他瞬时转染方法,或者使用稳定

转染细胞系

细胞通透性差

增加通透剂作用的时间或者浓度,或改用其它的通透剂
染色前的固定步骤破坏了抗原表位

改用其他固定方法

通透使抗原丢失

减少通透剂作用的时间或强度
抗体不识别换用其他抗体
一抗稀释度过大同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线,以确定最佳的一抗稀释比例
二抗选择错误使用正确的二抗
背景过高一抗质量不高使用特异性高,效价高的一抗
一抗浓度太高同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线,以确定最佳的一抗稀释比例
二抗浓度太高同一样品按最佳的一抗用量作二抗稀释曲线,以确定最佳的二抗稀释比例
封闭不完全使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭;改善封闭条件
封闭液BSA中含IgG

使用高纯度(IgG free)的BSA

洗涤不充分充分洗涤
细胞呈扁平状细胞片被风干
在任何时候都不要让细胞片干燥;使用湿盒
使用了甲醇固定甲醇可破坏细胞膜,因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛等其他固定剂
细胞有自发荧光使用了戊二醛固定在固定后荧光染色前进行荧光淬灭,如使用NaIO4,NaBH4,甘氨酸等,染色前检查自发荧光
材料本身(如石蜡)有自发荧光
细胞模糊,封片剂明亮因洗涤不充分导致背景太亮充分洗涤
二抗结合太弱

确保抗体牢固结合,确保固定良好

整个细胞片都出现荧光亮点
二抗浓度过高降低二抗浓度
二抗发生沉淀过滤或离心荧光标记二抗


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