酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay, 简写 ELISA) 是我们平常实验中经常会遇到的一种用于蛋白定量检测方法。

目前我们用到的大多数是双抗夹心 ELISA 方法。这篇文章主要是以这种 ELISA 为例，从 ELISA 试剂的选择和注意事项等方面一一详细介绍。

1. 试剂的选择

a）根据试剂的检测浓度范围选择

相同的指标不同类型的 ELISA 试剂检测的灵敏度不一样。

首先查阅几篇相关文献，对自己所检测的指标的浓度范围做到心中有数。这个指标的浓度不能低于试剂检测浓度范围的下限，这样会造成测不出，没有结果，这种情况下就要选择超敏 ELISA 试剂，或者其他更敏感的检测方法如化学发光检测方法等。

如果浓度高于试剂检测范围的上限，样本需要稀释，具体稀释倍数，做预实验来决定。

b）根据样本量和经费来选择

目前 ELISA 试剂有预包被（已经包被好包被抗体的）成套试剂盒和没有包被抗体的试剂（只提供包被抗体、检测抗体和 HRP）。

国外几家大的生物公司这两种类型的试剂都提供。这两种价格相差甚大，前者每个样本的检测成本接近后者的十倍。如果样本量大和 / 或经费紧张，在符合 a) 条件的情况下，可以考虑选择后者，同样可以检测出稳定的实验结果。

2. 注意事项

a）熟悉实验原理

任何实验我们首先应该熟悉实验原理，这是做出漂亮、可重复性的实验结果的前提，即使实验不成功，这也是我们分析失败原因的根据。

例如双抗夹心 ELISA 原理示意图如下，根据这张示意图我们知道，包被抗体和检测抗体都是过量的，在整个实验过程中有好几次的洗涤过程，分别是为了去除过量的包被抗体和检测抗体。

而最为关键的是最后一步的洗涤，如果残留有未与抗原结合的酶标抗体，因其带有能与底物反应的酶，那么这样就会导致检测结果偏高，因此最后一步的洗涤我们都会洗涤 5 次以上，做到充分洗涤。

双抗夹心 ELISA 原理示意图

b）底物 TMB 应分装

对于需要自己包被抗体的试剂盒，显色系统都需要我们自己准备，我们一般会购买 100ml / 瓶的 TMB。为了避免污染，我们会根据每次的实验需要，先按需分装出来。

c）标准曲线一定要做复孔

样本的结果是根据标准曲线换算的，因此标准曲线直接影响整个样本的结果。为了安全起见标准曲线一定要做复孔。

d）在加样和试剂时枪头一定要悬空，这样能避免污染。

e）每次加样和试剂都要保持匀速和按照同样的顺序，这样能保证均一性，对最后的显色和终止反应尤其重要。

让绝大部分样本的浓度范围落在标准曲线的上升区间最佳，这样检测的结果稳定。