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DUALmembrane膜蛋白酵母双杂交系统简介

原理

DUALmembrane系统是在传统的酵母双杂交系统的基础上,巧妙地利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)进行蛋白质相互作用的筛选。


泛素是一种含76个氨基酸的保守蛋白,它经常作为降解信号连接在蛋白质的N端。泛素能被其特异性的蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, UBPs)识别并从所连接的蛋白上切割下来,切割位点总是位于泛素蛋白的C端。在酵母细胞中,泛素可以分成两部分分别表达,即其N端部分(NubI, 第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub, 第35~76位氨基酸),后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。


NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白([NubI: Cub]-reporter)体系。值得注意的是,野生型NubI与Cub具有高亲和力并能自发重组形成异源二聚体。当野生型NubI 的第13位异亮氨酸被丙氨酸或甘氨酸取代后,NubG与Cub之间的亲和力降低。于是NubG与Cub-LexA之间只有依靠蛋白互作而连接起来,两个互作蛋白分别与NubG和Cub-LexA融合。这样,通过检测转录因子LexA的切割就可以检测2个蛋白之间的互作关系,该系统工作原理示意图如下图。


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DUALmembrane系统工作原理图

 

当位于细胞内质网膜上的两个蛋白发生相互作用时,分别融合于其氨基酸C端的泛素蛋白前半部分(Cub)和后半部分(NubG)因距离靠近而形成一个完整的泛素蛋白分子,于是诱导UBPs识别并于其C端进行剪切,从而释放出转录因子LexA,最终启动核报告基因(HIS3 和lacZ)的转录。HIS3 作为营养缺陷型选择标记,而lacZ 转录后的β-Gal活性则作为阳性克隆的主要选择性标记。VP16作为诱饵融合蛋白的识别标签用于融合蛋白的表达和定位检测。


应用:

用于膜互作蛋白文库的筛选,也可以应用于2个已知蛋白(其中一个属膜蛋白)间互作关系的验证。

 

优点:

  • 在体内原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号。

  • 使用小的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化。

  • 蛋白间的互作信号靠泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动,而不是靠转录,因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列。

  • 此体系可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用。

  • 任何一种膜蛋白都可以作为诱饵,能使与待检测蛋白融合的相互作用模块(Cub-PLV-NubG)定位在细胞质内。

 

缺点:

  • 使用方法上的局限性。该系统所研究的蛋白质融合表达的Cub端必须定位于胞质内,才能激活报告基因的表达。因此,并非所有的膜蛋白都适用该系统,比如那些N、C端同时在细胞质膜外侧或内质网腔内的蛋白质则不适用于这种方法。

  • 实验结果的假阳性。即通过酵母双杂交实验所筛选到的蛋白质互作因子在细胞内不一定是真实发生的。这是酵母双杂交技术普遍存在的现象。据统计,在已筛选出的约八万种蛋白质相互作用中,只有2400种相互作用得到了多于一种方法的确认,验证成功率只有3%左右。因此,在酵母双杂交系统的应用中必须考虑产生假阳性的因素。该系统筛选表达文库产生假阳性的途径可能来自两个方面,其一是表达的诱饵(bait)融合蛋白和空猎物(prey)载体(NubG)结合启动下游的转录;其二是表达的诱饵(bait)融合蛋白和任意的猎物(prey)载体(NubG)结合启动下游的转录。一般情况下,前者的可能性比较小,因为空猎物(prey)载体在没有目标蛋白基因插入的情况下其下游的NubG不能正常表达,实验中可用阴性对照加以排除,或者使用3-AT (3-Aminotriazole, 3-氨基三唑)作为竞争抑制剂将本底控制在可接受水平。后者则需要结合阳性对照和3-AT的使用来降低干扰背景。双筛选系统和假阳性显示分析法可基本消除这两种情况下的假阳性。当然,要获得更加确切的信息还需要结合免疫共沉淀、双分子荧光标记互补法等实验结果加以分析。

  • 实验结果的假阴性。有些融合蛋白表达后会对酵母细胞产生毒性,从而抑制系统下游报告基因(如-his, lacZ)的表达或影响酵母细胞的正常生长,甚至碰到蛋白间相互作用较弱的情况,使得报告基因不表达或表达程度低而检测不到信号,这些原因都可以导致酵母双杂交呈现假阴性的实验结果。所以,目的蛋白的正确翻译与定位是该系统正常运转的前提,考虑到膜蛋白表达的困难性,该系统采用了不同类型的启动子来诱导蛋白质的表达,实验中可根据目的蛋白的性质灵活选择。由于DUALmembrane系统是近几年才发展起来的酵母双杂交衍生体系,应用范围还不是很广,实验结果积累不够充分,因此其文库筛选效率还有待于更进一步的实验证实。

 


参考文献:

赵小兰和彭昌操, 2010, DUALmembrane系统——一种膜蛋白质互作的研究方法, 基因组学与应用生物学(Online) Vol.29 No.2 (doi: 10.5376/gab.cn.2010.29.0002)

 


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