01实验动物
新西兰大白兔
02实验主要试剂
(1)PBS:从CellMax购买的PBS缓冲液。
(2) DMEM细胞生长培养液:临用前根据需要加10%胎牛血清(CellMax),后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。
(3)抗生素:从CellMax购买的双抗试剂。
(4)细胞冻存液:生长培养基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清,加入10%的DMSO混合均匀,置于4℃冰箱保存。
03实验步骤
(1)取成年新西兰大白兔,耳缘静脉注射空气处死后,取下兔子的双腿,立即用75%乙醇浸泡。
(2)移入细胞房内,去除双腿表面的皮毛及肌肉,剪取关节段,移至超菌工作台内。
(3)PBS洗涤数次,用手术刀或弯剪将关节表面的软骨组织取下。
(4)软骨组织块静置5min,弃去上层液体及悬浮组织,将软骨组织剪成1mm3的大小。移到离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶,置入37℃的恒温摇床中,振荡消化15-20min;
(5) 4℃静置5min;弃上清,PBS洗涤,去上清。加入0.2%胶原酶II,置入37℃的恒温摇床中,振荡消化2H;
(6)加入生长培养基终止消化,反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min,弃上清,用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养;
(7)细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全展开后即可固定做原代鉴定。
注意事项:
可用手术刀取材;尽量取新生的大白兔取材;这样细胞活性高,量大,取材方便;
在消化时可以放置在摇床上,效率比放置在孵箱里高;
消化时多观察,至组织块大致消失就可以终止消化了。接种后48H再换液,这样细胞才帖牢不掉。第三、四天多观察,细胞在会爆发:
软骨组织
剔除组织
软骨取材
剪碎组织
04细胞形态
膝关节软骨原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞三角或多角形,生长缓慢,培养3-5天进入快速增殖期。
贴壁24h细胞
传代后细胞