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原代细胞分离之小鼠原代肝细胞要点详解

商品化的细胞往往伴随着永生化处理,目的在于将所获得的细胞与在体细胞具有一致的表型,但仍有一些商品化细胞无法满足实验需求。正因为这样,很多同学在做研究的时候就会用到原代细胞,也就是从机体的组织器官上直接分离相应的细胞来满足实验需求,今天就跟大家分享一个常用到的小鼠原代肝细胞的分离方法。

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一、实验动物

小鼠:周龄6-8周,常用品系:ICRC57BL/6

(PS:越年轻的小鼠分离得到的原代细胞活力越好!)


二、实验器材

留置针、眼科剪、显微止血夹、50ml注射器、医用胶带、弯头镊3-4把、筛网、10cm培养皿5-6个。


三、实验试剂

麻醉剂、HBSS(可购买带酚红商品化HBSS)、无水CaCl2EGTANaOH、胶原酶、HEPESIV型胶原酶、DMEM高糖培养基、percoll溶液。


四、实验前准备

1、器械灭菌:将弯头镊、眼科剪、止血夹等器械高温灭菌或浸泡在75%乙醇中过夜。

2、试剂配置:①NaOH溶液的配置:称取适量NaOH配成4mM/L的溶液;②缓冲溶液一:在HBSS中加入EGTA,并用配置好的NaOH溶液进行pH值调整至弱碱性(可用pH计测定,也可用pH试纸测定,不超过8.0);③缓冲溶液二:在HBSS中加入HEPES和无水CaCl2,调整pH至弱碱性,加入一定量的IV型胶原酶。

将灭菌好的器材转移至超净台中并紫外照射30min,配置好的缓冲溶液一、二放置于水浴锅内进行37℃水浴。


五、实验步骤

1、小鼠麻醉

根据体重计算相应的麻醉剂量并腹腔注射(也可以用异氟烷进行空气麻醉)

2、对完全麻醉后的小鼠进行解剖,打开腹腔,找到小鼠下腔静脉及门静脉,使用滞留针插入下腔静脉,将50-60ml的缓冲溶液一在10-20min内缓慢注射进入小鼠血液循环内,看到小鼠肝脏有明显肿胀时剪开门静脉,完成后改用缓冲溶液二进行冲洗。

3、冲洗完成后,将小鼠肝脏剪下,转移至DMEM高糖培养基,用DMEM培养基清洗2-3次后,使用灭菌镊子将肝脏在培养基内撕开,使原代肝细胞从肝脏内流出。

4、将分离得到的肝脏细胞过筛网筛选,过滤组织碎块及其他杂质,并对细胞混悬液离心,按照一定的离心力得到初步的肝细胞沉淀,此时的肝细胞中混杂着肝脏实质细胞和非实质细胞,需要使用percoll离心液进行梯度离心。

5、梯度离心后的细胞即为原代肝脏实质细胞,重悬后计数即可用于后续的实验,若对细胞纯度存疑,也可以进行流式测定。



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