商品化的细胞往往伴随着永生化处理，目的在于将所获得的细胞与在体细胞具有一致的表型，但仍有一些商品化细胞无法满足实验需求。正因为这样，很多同学在做研究的时候就会用到原代细胞，也就是从机体的组织器官上直接分离相应的细胞来满足实验需求，今天就跟大家分享一个常用到的小鼠原代肝细胞的分离方法。
一、实验动物
小鼠：周龄6-8周，常用品系：ICR、C57BL/6
（PS：越年轻的小鼠分离得到的原代细胞活力越好！）
二、实验器材
留置针、眼科剪、显微止血夹、50ml注射器、医用胶带、弯头镊3-4把、筛网、10cm培养皿5-6个。
三、实验试剂
麻醉剂、HBSS（可购买带酚红商品化HBSS）、无水CaCl2、EGTA，NaOH、胶原酶、HEPES、IV型胶原酶、DMEM高糖培养基、percoll溶液。
四、实验前准备
1、器械灭菌：将弯头镊、眼科剪、止血夹等器械高温灭菌或浸泡在75%乙醇中过夜。
2、试剂配置：①NaOH溶液的配置：称取适量NaOH配成4mM/L的溶液；②缓冲溶液一：在HBSS中加入EGTA，并用配置好的NaOH溶液进行pH值调整至弱碱性（可用pH计测定，也可用pH试纸测定，不超过8.0）；③缓冲溶液二：在HBSS中加入HEPES和无水CaCl2，调整pH至弱碱性，加入一定量的IV型胶原酶。
将灭菌好的器材转移至超净台中并紫外照射30min，配置好的缓冲溶液一、二放置于水浴锅内进行37℃水浴。
五、实验步骤
1、小鼠麻醉
根据体重计算相应的麻醉剂量并腹腔注射（也可以用异氟烷进行空气麻醉）
2、对完全麻醉后的小鼠进行解剖，打开腹腔，找到小鼠下腔静脉及门静脉，使用滞留针插入下腔静脉，将50-60ml的缓冲溶液一在10-20min内缓慢注射进入小鼠血液循环内，看到小鼠肝脏有明显肿胀时剪开门静脉，完成后改用缓冲溶液二进行冲洗。
3、冲洗完成后，将小鼠肝脏剪下，转移至DMEM高糖培养基，用DMEM培养基清洗2-3次后，使用灭菌镊子将肝脏在培养基内撕开，使原代肝细胞从肝脏内流出。
4、将分离得到的肝脏细胞过筛网筛选，过滤组织碎块及其他杂质，并对细胞混悬液离心，按照一定的离心力得到初步的肝细胞沉淀，此时的肝细胞中混杂着肝脏实质细胞和非实质细胞，需要使用percoll离心液进行梯度离心。
5、梯度离心后的细胞即为原代肝脏实质细胞，重悬后计数即可用于后续的实验，若对细胞纯度存疑，也可以进行流式测定。
