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干货,提取RNA的那些小技巧

今天给大家带来《qRT-PCR》之---如何提取细胞RNA?

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一、基本原则


避免RNA酶污染,全程戴口罩和无菌乳胶手套(汗液和唾液中含有大量RNA酶)




二、主要试剂及仪器


Trizol、氯仿(三氯甲烷)、异丙醇、无水乙醇、DEPC水(或ddH2O)




三、操作步骤(全程戴口罩和手套)


1、Trizol处理。将细胞培养基吸出后,用预冷PBS洗涤3次,加入1ml Trizol(100mm培养皿),室温裂解1-2min,用移液枪均匀吹下细胞并置于无菌1.5ml EP管,上下轻柔颠倒数次,室温静置5min。

2、加入1/5体积氯仿,颠倒混匀10次,室温静置5min,4度,12000rmp,离心20min。(离心机提前预冷至4度)

3、将水相转移至新EP 管(缓吸、宁缺毋滥),加入等体积异丙醇,颠倒混匀10次,室温静置10min,4度,12000rmp,离心15min。

4、用真空泵或移液枪小心吸取上清液,加入预冷75%乙醇(无水乙醇配置),4度,12000rmp,离心10min。

5、弃上清液,EP管倒扣,空气干燥5~10min。

6、10~100ul DEPC水(或ddH2O)溶解。

7、NanoDrop 2000超微量分光光度计定量,读取OD260/OD280比值。若比值在1.8~2.0之间,可进行下一步逆转录反应,若低于1.8,可能存在蛋白污染。

8、若暂时不逆转录,RNA置于-80度冰箱保存。




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