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什么是荧光原位杂交(FISH)?

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什么是FISH



FISH:采用了已知序列的、特异性的单链核酸作为探针,标记了生物素或荧光素,在一定的温度和离子浓度下通过碱基互补配对法则,使得DNA-DNA原位杂交,采用荧光法显示,最终将DNA在细胞爬片、组织切片(石蜡切片or冰冻切片)的原始位置上标记出来的一种技术。


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上一代的FISH还是采用的同位素进行标记,现在基本上都是荧光标记了。在此,要感谢J.G.Baunlan这位大神了。


有了FISH,我们可以不再仅仅依赖分子生物学的方法来检测DNA的表达了。FISH技术最大的优点是可以在间期细胞核上直接观察到DNA扩增,并且荧光信号的强度直接与DNA扩增水平直接相关。这些都大大促进了分子细胞遗传领域的科学研究,同时也是临床上诊断肿瘤的利器。



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FISH的实验要点



网上有很多关于FISH的实验步骤教程,但每个探针盒子的操作可能存在差异。懂了原理,才能以不变应万变。因此,本部分主要是详细讨论实验要点。


FISH的大致步骤分为探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(适用于适用生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。


要点:


(1)良好的前期标本制备十分重要,这点对于采用秋水仙素刺激得到中期染色体分裂象尤为重要。刺激时间过短或过长都会影响实验观察,因此需要耐心摸索作用时间。


(2)蛋白酶K的作用浓度。浓度高了极易影响细胞核形态,造成模糊不清,浓度低了则探针不易进入细胞核,杂交率大大降低。石蜡切片一般要达到10-30min,不要超过半小时,一般来说,20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min足矣。


(3)探针标记。市售的探针盒子花样繁多,尽量选择大品牌的试剂盒。严格按照其操作步骤和条件进行。不同厂家的盒子中使用的酶存在差异,因此这一步操作需要根据实际情况操作。


(4)杂交液滴到组织上后不要暴力掀开盖玻片,而是在漂洗的时候采用滴管在其侧面滴洗,轻轻冲下盖玻片。这一步是很有必要的!而在封片时,一定要密封好玻片,可以采用凝胶类的物质封住四周。


(5)杂交条件一般是37℃避光湿盒过夜。至少温度要严格控制在37-40℃,过高或者过低都是不适合的。孵育时间也不要无限延长,一般18-20h就肯定够了,时间过久会造成自动解链,造成信号降低。


(6)漂洗液的温度控制。很多人都觉得这个无所谓。小编个人认为FISH实验是一个对温度非常敏感的实验。保证漂洗液温度为37℃而不是室温,可能对于整个实验有比较良好的影响。


(7)封片后标本要尽快检测和观察。每一次荧光显微镜的观察都会淬灭一部分信号,因此一定要快速观察和采集图像。有条件的话,小编推荐大家尽量选用共聚焦显微镜采集图像,荧光显微镜备选。


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此外,老生常谈的就是严防整个实验过程中的酶污染问题,玻片、手套。实验器材等均要严格灭酶后使用,否则从一开始就出问题了。



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石蜡切片的FISH要点



实际情况下,并不是每个人都有条件选择冰冻切片进行FISH实验。实际上,石蜡切片也是可以做FISH的,只是其中一些步骤可能需要我们多加注意。


(1)组织固定,采用PH7.2的10%甲醛固定24h是比较适合的,PH很重要。较厚的组织块建议切开后再固定。这一点小编已经反复提过很多次了。良好的固定是所有病理实验的前提。


(2)对于石蜡切片来说,采用蛋白酶K作为消化液是更优的选择。消化条件20g/L蛋白酶K在50℃下消化20min。胃蛋白酶是极易失活的,失活了就没法充分消化,消化过度又会使细胞核变模糊。综合来看,小编更推荐蛋白酶K。


(3)石蜡切片的杂交温度一般都是37摄氏度。而杂交时间则需要摸索才能得到最佳时间。不过,一般的过夜孵育基本可以达到目的。


(4)FISH实验中非特异性着色是个难以避免的问题,我们能做的就是尽量减少背景。具体可作为的地方:充分严格漂洗、全程避免干片、探针浓度不宜太高、杂交温度要控制在37℃。



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原位杂交与免疫组化的结合



这是一项难度较高的操作,如果你所在的实验室没有相应的SOP指导就更难了。



一般情况下,相对于蛋白来说,DNA和RNA都是比较脆弱的。因此首先应该先完成FISH,然后再开展免疫组化。


小编在此推荐一个可借鉴的操作流程,供参考。


原位杂交在前。


(1)常规脱蜡入水。

(2)37℃蛋白酶K消化20min,37℃漂洗液充分洗去蛋白酶K。

(3)滴加探针,加盖玻片,避光、湿盒、37℃过夜孵育。

(4)如果试剂盒允许的话,将试剂盒中洗脱液水浴加温至37℃震荡洗脱多余的探针。

(5)加碱性磷酸酶标记的抗体,37℃孵育半小时,洗去抗体后显色。


免疫组化在后。


(1)将显色后确认为阳性的切片充分漂洗。

(2)在PH为6.0的枸橼酸钠溶液中,微波至96℃左右,作用10min。

(3)滴加一抗,37℃湿盒孵育2h。

(4)充分漂洗切片,滴加二抗,室温下孵育40-50min。

(5)DAB显色后,采用PBS中止显色反应。

(6)不要复染核,不然就盖住原位杂交信号了。


所有的耗材、器材均需采用DEPC水浸泡。第一步的杂交之后要充分洗脱,漂洗也要充分,但是漂洗也要尽量温柔,防止脱片。免疫组化的各个漂洗步骤、抗体孵育时间要比平常延长至少1倍的时间。


免疫荧光标记+FISH,这里面更为复杂。


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