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超全整理!液相色谱的常见故障有哪些?如何排除?

高效液相色谱 ( HPLC)广泛应用于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。在使用过程中难免会遇到各种各样的问题,从而影响正常工作,如何快速发现故障、排除故障,并做好预防维护措施及其重要,小析姐列举了常见故障的排除及解决方法,仅供大家参考。

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常见故障排除



1、压力高

压力偏高或超过压力上限一般是由方法问题、误操作、系统堵塞、压力传感器故障等问题引起。

方法问题:在方法建立时柱温、流速等参数建立不当,当使用小粒径色谱柱或背压大的色谱柱时,可降低流速或升高柱温(如35~40℃),以降低系统压力,该问题多发生在建立方法时。


误操作:当压力高于平时压力时首先检查柱温是否设置错误、流动相溶剂是否使用错误(如错将甲醇用成了粘度高的乙腈)、色谱柱是否拿错等误操作。


系统堵塞:排除方法问题及误操作后,排查是否系统堵塞,进行分段排查,可依次松开管路接头,从HPLC出口端开始,向上游泵逐个检查,这是发现堵塞部位最简单的方法,确定堵塞部位后可进行直接更换(如安捷伦的过滤白头等)、或超声清洗(如waters的在线过滤器等)、或反冲(如六通阀、进样针、针座、管路等部位),如超声清洗或反冲无效则需更换,经排查是保护柱或色谱柱堵塞时按相关方法冲洗。


压力传感器故障:上述排查后未发现压力高原因,则需要更换压力传感器,联系仪器客服咨询。



2、压力低

压力偏低或无压力一般是由误操作、漏夜、泵不输液等问题引起。


误操作:泵关闭、打开了排空阀等误操作引起无压力、柱温设置错误、用错溶剂、用错色谱柱等误操作可能导致压力偏低或偏高。


漏夜:压力偏低或无压力很多时候是由漏夜引起,配有漏夜感应器先确认哪个模块漏夜报错(此时已经严重漏夜),清除错误后重新启动泵排查该模块漏夜位置(用滤纸或纸巾逐个接口试漏),未配有漏夜感应器或轻微漏夜时由泵至检测器逐个接口排查(漏夜多发生在色谱柱接口及泵各接口)。确定漏夜位置根据漏夜原因进行处理,如接口松动重新拧紧、如密封圈磨损更换密封圈等。


泵不输液:流动相走空、管路中有空气、未充分排空、溶剂入口过滤头堵塞、单向阀污染均可能引起泵不输液。首先检查溶剂瓶内是否有溶剂、管路中是否充满气体,进行排空(如排空废液口无液体流出使用注射器手动抽,至有连续液体流出);排空后依然无压力、压力偏低或压力波动,且废液口无废液流出,超声清洗单向阀或更换单向阀,无改善将溶剂入口过滤头取下,查看压力是否正常,如滤头堵塞超声清洗或更换(注:安捷伦溶剂入口过滤头为陶瓷材质,不可以超声,使用1%~10%硝酸浸泡过夜)。



3、保留时间变动

如果所有峰(色谱峰)的保留时间均发生了变化,其原因很可能是流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速、在线混合时比例阀故障等。


流动相的组成:如果操作人员操作不当,则会导致流动相组成的意外变化,例如使用在线式混合系统时,流动相混合物(系统)设置不正确;或替换新批次流动相时,未妥善制备新的流动相(新流动相配制不正确)。在极少数情况下,会出现流动相组分选择性损失的情况,例如蒸发。


当流动相发生变化时,峰形(色谱峰)通常会向相同的方向移动,以缩短或延长保留时间(保留时间变长或变短);而相对保留通常会发生变化。检查流动相组成错误的最佳方法是仔细检查(复查)系统设置;如有必要,应制备新的流动相。


色谱柱化学(化学性质)变化:一般会在色谱柱使用数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化(漂移)(更长或更短)以及更多的峰拖尾。更换新柱以确定是否是柱老化导致的保留时间变动。


色谱柱温度变化:柱温变化会导致保留时间的变化,每1℃的温度变化会引起1-3%的保留时间变化。如果不使用柱温箱(即“室温”条件),实验室温度通常会变化。尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时,温度变化极为明显。使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题,且HPLC系统应远离通风口放置。


流速变化:可能是因存在气泡、泄漏或泵问题(故障)导致流速与设定值发生变化,导致保留时间变化。


气泡问题:可能伴有柱压过低或柱压波动,且保留时间延长。对于双头泵,如果只有一个泵头存在气泡,则流量和压力可能会发生脉动。


泄漏也会延长保留时间。查看接头如有液滴或结晶析出,可证明有泄露。请特别注意色谱柱之前的接头。如果使用不锈钢配件,通常将接头螺母手动拧紧,再扳手拧紧1/4圈,便可以阻止泄漏。使用PEEK接头时,应停止泵,松开接头,将管路推到接口端口的底部,再拧紧接头。拧紧PEEK接头时如果存在流动的液体,会导致管道在配件中滑动,产生柱外死体积,进而影响分离效果。


单向阀污染或泵密圈磨损会导致流量偏低或波动,从而导致保留时间变化。单向阀污染可以进行超声清洗,随着使用时间的增加,泵密封圈会出现磨损,而且使用高浓度缓冲盐为流动相,会缩短泵密圈的使用寿命,可以根据使用情况及密封圈故障率定期更换密封圈,通常一年更换一次即可。



4、问题峰

(1)拖尾峰

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1、筛板阻塞:柱子两头的过滤筛板如果堵塞,样品就会在筛板部分受阻而形成时间延迟,使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。需要通过反冲色谱柱,或者更换筛板。
2、色谱柱塌陷:是指色谱柱由于其它原因引起了柱效率丧失,不能对物质形成保留,使得物质不在固定相上保留而随流动相流出,但是又还有一点柱效,因此形成拖尾。需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。
3、有污染:即样品不在同一起跑线起跑,从后面开始跑得到达终点稍晚,表现出拖尾。更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1h以上,以冲洗柱子。
4、流动相PH值选择错误:如某PH下有的样品存在分子型和离子型的动态平衡,离子型的陆续向分子型转化就会表现出拖尾。调节PH值可抑制分子解离,改善拖尾,对于碱性化合物,相对较低的PH值更有利于得到对称峰。
(2)前沿峰
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1、样品过载:被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来,形成前沿峰。降低样品含量。
2、样品溶剂选择不恰当:当样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相时会出现前沿峰,例如,在反相色谱中用已腈做样品溶剂,而流动相的洗脱力较弱时会出现前沿峰。选择流动相或者接近流动相的比例作为样品溶剂。
3、色谱柱损坏:色谱柱柱效损失,不能对物质形成保留。更换色谱柱。
4、在大峰前有小峰出现,假象前沿峰,即大峰前包埋了没有分开的小峰。调整流动相洗脱梯度。
(3)倒峰
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1、样品折射率小:示差折光检测器测的信号是折射率,出现倒峰的原因是组分的折射率小于流动相。

2、密度的原因:密度不一样,出来的峰正倒不一样。

3、进样所致:进样时,样品对原有流动相产生瞬间阻断,然后瞬间涌流,所以产生先倒后高的“溶剂峰”。

4、基本不可避免:试着使用与流动相相同的溶剂作为溶样溶剂,另外进样之前注意平衡跟冲洗参比池。倒峰基本上不能避免,但是这样操作会小些。


(4)包裹
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1、色谱柱问题:色谱柱流失,柱子被污染。

2、样品溶解度差:温度可能会影响到溶解度。

3、流动相不均匀:一般是流动相没配好,管路流动相不均匀,也会导致上述现象。


(5)基线漂移
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1、柱温波动:即使是很小的温度变化都会引起基线的波动,通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。使用柱温箱,控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器。
2、流动相不均匀:流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。使用HPLC级的溶剂,流动相在使用前进行脱气处理。
3、流通池被污染或有气体:用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。
4、流动相配比不当或流速变化:更改配比或流速,为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
5、样品中有强保留的物质:以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
(6)出现宽峰
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1、色谱柱污染或失效,造成塔板数降低:更换同样类型的色谱柱,如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。
2、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大:更换内径较小的短管路。
3、检测器对反应时间或池体积响应过大:减少响应时间或使用更小的流通池。
(7)基线噪音
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1、在流动相、检测器或泵中有空气(尖锐峰):流动相脱气,冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液:检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。
3、流动相混合不完全:用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂。
4、温度影响(柱温过高,检测器未加热):使用柱温箱,减少温度差异或加上热交换器。
5、在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声):断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。采用精密级稳压电源。
(8)分离度不够
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1、流动相梯度洗脱设置不合理:优化梯度洗脱程序。
2、流动相污染或变质(引起保留时间变化):重新配置流动相。
3、保护柱或分析柱阻塞:去掉保护柱进行分析,如果必要则更换保护柱;如果分析柱阻塞,可进行反冲;如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序;如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。


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