原理：

十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种蛋白表达分析技术。SDS是一种阴离子表面活性剂，与蛋白质充分混合后破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白质完全变性并带上负电荷。PAGE包含浓缩胶和分离胶，样品首先通过浓缩胶，使样品中所有SDS多肽复合物在分离胶表面聚成一条很薄的区带，使全部样品处于同一起跑线上；分离胶具有分子筛效应，将样品中不同分子量的大小的蛋白质彼此分开。SDS-PAGE常用于检测蛋白的表达量、表达分布，或分析蛋白的纯度等。

SDS-PAGE实验流程（来源Sigma官网）

溶液准备：

• 电泳缓冲液：3 g Tris-base，14.4 g甘氨酸，1g SDS，溶于1 L蒸馏水中。

• 蛋白上样缓冲液（6× SDS loading buffer）。

• 试剂盒：以康为世纪凝胶制备试剂盒（CW0022A）为例。

• 考马斯亮蓝染色液：称取1 g考马斯亮蓝R-250溶于400 mL ddH2O中，加入450 mL甲醇，100 mL冰醋酸，最后加ddH2O定容至1 L。

• 脱色液：甲醇100 mL，冰醋酸100 mL，ddH2O定容至1 L。

实验流程：

1.  制胶：根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度。

1）灌制分离胶：

①装配好凝胶模具。（注：加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触，是否加入上层筛板可根据实际情况选择。）

②将不同体积的30% Acr-Bis (29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer和纯水在小烧杯或试管中混合。

③加入10% APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

④在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可）， 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1 cm的水层，速度不能太快，使凝胶表面保持平整。

⑤静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，表面凝胶已聚合。

2）灌制浓缩胶（各试剂使用量请参考附表2）

①去除覆盖在分离胶上的水层。

②将不同体积的30% Acr-Bis (29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer和纯水在一个小烧杯或试管中混合。

③加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

④将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

⑤将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

⑥静置10~20分钟，等待浓缩胶聚合。

⑦待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免气泡破坏加样孔，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。

2.  样品处理：在蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液，稀释至1×（如蛋白样品有50μl，则加入6x缓冲液10μl），混匀，沸水或95-100℃加热5min，然后适当离心收集样品至管底。

3. 上样：将处理好的样品按照设计好的顺序加入到点样孔中，每孔中样品量尽量相等，不要过多。一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul- 40ul蛋白样品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul -30ul蛋白样品。用微量注射器加样，也可以用普通的移液枪加样，尽量让枪头深入梳孔底物，防止蛋白样品飘出上样时尽量让枪头深入梳孔底部，防止样品飘出，一般在目的蛋白两侧加入等量的marker，如果两侧有空的梳孔，应该加入1X的loading buffer，起“压边”作用，使电泳时蛋白样品在一条水平线上。上样完毕后，盖上电泳槽盖子，连接电泳仪。注意正负极不能接反。

4. 电泳：先将电压设置为90 V，待样品进入分离胶后，调整电压为100-150 V。当溴酚蓝接近前沿时，停止电泳。如分子量较小，则注意前沿位置及时停止电泳。如分子量较大，可以延长电泳时间。全程大约需要1-2 h。

5. 将电泳后的PAGE胶取下放在塑料盒中，加入适量染色液，室温，于摇床上慢慢摇动30 min。

6.  将胶转移至脱色液中，在摇床上摇动5-10 min，弃去脱色液（此时蛋白条带应已可见）。可换脱色液继续脱色至条带清晰。

7. 若要快速染色，可将塑料盒放入微波炉中加热至沸腾。取出后于室温，置于摇床上慢慢摇动10 min即可。

考染胶图示例（图片来源于网络）

说明：

DS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚蓝，作为指示剂，方便观察电泳进行的程度；B：10%甘油，密度大，增加样本的重量，可携带样本沉到底部；C：2%SDS，是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物，是蛋白质带满负电荷，从而是蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响；D：巯基乙醇还原剂，使蛋白质的二硫键断开，使得蛋白保持线性结构。