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Protocol:SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色及脱色

原理:

十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)是一种蛋白表达分析技术。SDS是一种阴离子表面活性剂,与蛋白质充分混合后破坏蛋白质的二级和三级结构,使蛋白质完全变性并带上负电荷。PAGE包含浓缩胶和分离胶,样品首先通过浓缩胶,使样品中所有SDS多肽复合物在分离胶表面聚成一条很薄的区带,使全部样品处于同一起跑线上;分离胶具有分子筛效应,将样品中不同分子量的大小的蛋白质彼此分开。SDS-PAGE常用于检测蛋白的表达量、表达分布,或分析蛋白的纯度等。

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SDS-PAGE实验流程(来源Sigma官网)



溶液准备:

  • 电泳缓冲液:3 g Tris-base,14.4 g甘氨酸,1g SDS,溶于1 L蒸馏水中。

  • 蛋白上样缓冲液(6× SDS loading buffer)。

  • 试剂盒:以康为世纪凝胶制备试剂盒(CW0022A)为例。

  • 考马斯亮蓝染色液:称取1 g考马斯亮蓝R-250溶于400 mL ddH2O中,加入450 mL甲醇,100 mL冰醋酸,最后加ddH2O定容至1 L。

  • 脱色液:甲醇100 mL,冰醋酸100 mL,ddH2O定容至1 L。

 

实验流程:

1.  制胶:根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度。

SDS-PAGE 分离胶浓度

最佳分离范围

6%

50-150 kD

8%

30-90 kD

10%

20-80 kD

12%

12-60 kD

15%

10-40 kD


1)灌制分离胶:

①装配好凝胶模具。(注:加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触,是否加入上层筛板可根据实际情况选择。)

②将不同体积的30% Acr-Bis (29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer和纯水在小烧杯或试管中混合。

③加入10% APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。

④在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可), 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1 cm的水层,速度不能太快,使凝胶表面保持平整。

⑤静置30-60分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,表面凝胶已聚合。


2)灌制浓缩胶(各试剂使用量请参考附表2)

①去除覆盖在分离胶上的水层。

②将不同体积的30% Acr-Bis (29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer和纯水在一个小烧杯或试管中混合。

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③加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。

④将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

⑤将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。

⑥静置10~20分钟,等待浓缩胶聚合。

⑦待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,以免气泡破坏加样孔,若上样孔有变形,可用适当粗细的针头拨正。


2.  样品处理:在蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液,稀释至1×(如蛋白样品有50μl,则加入6x缓冲液10μl),混匀,沸水或95-100℃加热5min,然后适当离心收集样品至管底。


3. 上样:将处理好的样品按照设计好的顺序加入到点样孔中,每孔中样品量尽量相等,不要过多。一般10孔的梳孔,每孔可以加入20ul- 40ul蛋白样品,15孔的梳孔,每孔可以加入10ul -30ul蛋白样品。用微量注射器加样,也可以用普通的移液枪加样,尽量让枪头深入梳孔底物,防止蛋白样品飘出上样时尽量让枪头深入梳孔底部,防止样品飘出,一般在目的蛋白两侧加入等量的marker,如果两侧有空的梳孔,应该加入1X的loading buffer,起“压边”作用,使电泳时蛋白样品在一条水平线上。上样完毕后,盖上电泳槽盖子,连接电泳仪。注意正负极不能接反。


4. 电泳:先将电压设置为90 V,待样品进入分离胶后,调整电压为100-150 V。当溴酚蓝接近前沿时,停止电泳。如分子量较小,则注意前沿位置及时停止电泳。如分子量较大,可以延长电泳时间。全程大约需要1-2 h。


5. 将电泳后的PAGE胶取下放在塑料盒中,加入适量染色液,室温,于摇床上慢慢摇动30 min。


6.  将胶转移至脱色液中,在摇床上摇动5-10 min,弃去脱色液(此时蛋白条带应已可见)。可换脱色液继续脱色至条带清晰。


7. 若要快速染色,可将塑料盒放入微波炉中加热至沸腾。取出后于室温,置于摇床上慢慢摇动10 min即可。


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考染胶图示例(图片来源于网络)


说明:

DS loading buffer 的主要成分及作用:A:0.1%溴酚蓝,作为指示剂,方便观察电泳进行的程度;B:10%甘油,密度大,增加样本的重量,可携带样本沉到底部;C:2%SDS,是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的氢键和疏水键,按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物,是蛋白质带满负电荷,从而是蛋白带电荷一致,减少电荷对电泳结果的影响;D:巯基乙醇还原剂,使蛋白质的二硫键断开,使得蛋白保持线性结构。


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