RNA干扰（RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链 RNA 引发的，广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。胞质中的核酸内切酶 Dicer 将 dsRNA 裂解成由 21-25 个核苷酸组成的 siRNA，随后 siRNA 与体内蛋白结合形成 RNA 诱导的沉默复合物RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，在结合部位切割 mRNA，被切割后的断裂mRNA随即降解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因等相关基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。

常规化学合成siRNA为21～23nt的双链小分子RNA，为冻干粉形式的即用型试剂 ，在常温不溶解的情况下可以保存至少1个月时间，放置于-20℃～-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。

1、将装有siRNA的离心管短暂离心（2000转速即可），确保siRNA位于离心管底部。
2、根据下表推荐的DEPC-DW(or RNase-free water) 使用量对siRNA进行溶解，DEPC水随siRNA免费提供。

3、 使用移液器上下吹打 3-5 次 (或短暂的涡旋震荡)。

4、 短暂低速离心，使液体聚集于离心管的底部。
5、 根据实际使用需求将siRNA分成小份并贮存于-20℃ (可保存一年)。为了保证最佳使用效果，反复冻融次数不要超过五次。

注：推荐使用长时间贮存（2个月以上）使用100pmole/μl浓度，且冻存于–70°C。

哺乳动物细胞的转染效率取决于转染细胞类型和使用的转染试剂。

转染试剂

建议在实验操作前，与转染试剂提供厂家确认细胞类型是否符合转染试剂使用范围，有无相关文献。

siRNA浓度

可选用1-100nM的浓度。建议使用梯度浓度找到适合您细胞系的转染效率高、细胞毒性小和基因沉默效果佳的转染条件。不同的细胞系和目的基因，需要使用的浓度可能不一样。

转染前细胞的融合率

一般建议转染前细胞融合率在30～60%。

监测转染效率
建议有荧光显微镜的实验室，在实验时设置荧光标记siRNA阴性对照组监测转染效率。

注：建议每次siRNA实验设置siRNA阳性和阴性对照组，以确保实验的可控制性，便于分析问题

示例：使用Lipofectamine RNAiMAX和HeLa cell 用于siRNA的在6孔板上进行的转染实验。

注：请实验前确认实验使用的细胞系是否适合转染试剂。

1、转染前一天，在6孔板中每个孔内播种 3.0 x 10^5 HeLa cells，每孔放2.5mL不含抗生素的生长培养基。这样在转染时会有50-60%的融合率。
2、 从细胞中去除生长培养基。
3、 加入1.5 mL新鲜的不含血清的生长培养基。
4、对于每个转染的孔，按照如下方法准备siRNA 和 Lipofectamine RNAiMAX 混合物。
4-1、在250μl的无血清生长培养基中加入100pmole siRNA，柔和混匀。

4-2、Lipofectamine RNAiMAX使用前要先混匀，然后在250μl生长培养基中加入5μl的Lipofectamine RNAiMAX进行稀释，室温下温育5分钟。
4-3、混合稀释好的siRNA和Lipofectamine RNAiMAX，室温下温育20分钟。
5、 加入混合物到含有HeLa cells的6孔板中，每孔终体积为2ML，并轻晃混匀。
6、 在37℃的二氧化碳培养箱中培养细胞 5-6小时。
7、 更换含有血清的培养基并培养细胞 24-48小时，直到进行基因敲除实验。

6孔板实验为例：
1、转染的当天，收集细胞离心，用含FBS的培养基重悬。
2、 在250μl的无血清生长培养基中加入100 pmole siRNA，柔和混匀。
3、 Lipofectamine RNAiMAX使用前要先混匀，然后在250 μl生长培养基中加入5μl的Lipofectamine RNAiMAX进行稀释，室温下温育5分钟。
4、混合稀释好的siRNA和Lipofectamine RNAiMAX，室温下温育20分钟。
5、加入1.5 mL细胞悬浮液，每孔终体积为2ML，并轻晃混匀。根据细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间。
6、 细胞在CO₂培养箱中37℃温育24-48小时后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育5-6 小时后，除去复合物，更换培养基。

siRNA 转染细胞后，siRNA 在细胞内一系列酶的作用下形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，识别并切割靶基因mRNA，诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应， 从而抑制了细胞内目的基因蛋白的表达，一般可从两个方面进行检测。

mRNA 水平 - QPCR检测：

siRNA的作用机理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接证明。一般在siRNA转染后24小时后即可检测到靶mRNA水平的降低，可采用细胞总RNA提取，全长cDNA合成，荧光定量实验即可检测到mRNA 的敲除效率。

蛋白水平 - WB检测：

siRNA引起靶基因mRNA的降解，从而影响了靶蛋白的表达。但蛋白水平检测时间受细胞内目的蛋白表达量、稳定性、半衰期、甚至其他调控等因素的影响，蛋白质水平下降的幅度与mRNA水平下降不一定成线性正比关系。一般在转染后48后开始WB检测，72，96 小时，甚至更长时间之后多点采样。