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miRNA实验与荧光素酶

miRNA对靶基因的调控是否真正的存在,最常用的方法就是荧光素酶报告基因。


荧光素酶


荧光素酶(luciferase,Luc)是指能催化不同底物(如荧光素、腔肠素等)发生氧化使其发射出荧光的一类酶的总,在许多昆虫、海洋生物和原核生物中均能分离得到。目前最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶(bacterial luciferase,BL)和萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FL)两大类。细菌荧光素酶是一种具有热不稳定性的异源蛋白二聚体,含有α、β 两个多肽亚基的加单氧酶,它能催化长链脂肪醛、还原性黄素(FMNH2)和O2的氧化反应,发出蓝绿光(λ=490 nm)。萤火虫荧光素酶由单一多肽链组成,在Mg2+、ATP、O2 存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧发光(λ=550~580 nm),FL 的检测线性范围宽达7~8 个数量级,检测灵敏度可达10的-19次方mol(比CAT 高100倍),现已成为哺乳细胞中的最常使用的报告基因。高灵敏度、多用途、半衰期短、背景极低和相对简单的分析方法是萤火虫荧光蛋白流行使用的主要原因。常用的检测荧光素酶的方法有液闪法和光照度计法。随着具有膜透过性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的发现和使用,无需裂解细胞即可检测酶的活性。

荧光素酶普遍具有灵敏度高、检测快速、方便等特点。荧光素酶通过载体构建可以研究基因组织的特异性表达;对一些细胞的生长和转移等变化进行实时观测和评估;在验证miRNA 靶基因中荧光报告载体实验则是目前的常用方法;有些情况如用逆转录酶病毒构建的方法在较长时间的培养中则发现表达荧光素酶的能力下降。荧光素酶能与蛋白产生融合,可以构建双报告基因的表达系统,如海肾荧光素酶与红色荧光蛋白、萤火虫荧光素酶与绿色荧光蛋白以及萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶等双表达系统。目前这类报告基因发展迅速、应用领域日趋广泛。



海肾荧光素酶基因(renilla luciferase,Rluc)是一种新型的荧光素酶报告基因,近年来发展迅速。该基因的cDNA 是从海洋中的珊瑚虫类腔肠动物海肾中克隆而来,然后与pRL 载体相连构建而成。Rluc 表达的蛋白是一种36 kD的单体酶(RLUC)能够催化可穿透细胞膜的肠腔酶氧化并发出荧光,酶在与其底物相互作用后,随着萤光素的氧化而发出荧光,并且反应效率很高,几乎所有输入反应的能量都被转化为光。还有研究认为,接触反应基团与荧光生成的去碳酸基反应直接相关,其他活性产物可用于底物的结合。在活细胞内,Rluc 表达产物还能作为Ca2+的荧光指示剂。


海肾荧光素酶作为一种新型的荧光素酶报告基因,有着更显著的优点:(1)低背景,灵敏度高,可检测10的-19次方mol 的海肾荧光素酶,比已发表的方法灵敏度高几个数量级;(2)线性范围广,能得到可靠的、超过7 个数量级酶活力的结果;(3)RLUC 的检测既可用终点法检测,也可用于非裂解性检测

目前已经有十分成熟的可同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的系统,我们通常称为双荧光素酶报告系统。



实验的基本原理


由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用,可以将目的基因3’UTR区域构建至报告基因luciferase的后面,通过比较过表达或者干扰miRNA后,报告基因表达的改变(监测荧光素酶的活性变化)可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用


下载 (1).jpeg


进行验证实验之前已经准备好的内容如下:

靶基因的3UTR序列;

研究的miRNA的mimics;


实验流程:

需要将靶基因的3’UTR构建入pmirGLO载体中,载体图谱如下:




下载 (2).jpeg

该载体包含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶双报告基因,实验中需要将靶基因的3’UTR 通过该载体的多克隆位点连入萤火虫荧光素酶报告基因的下游。

获得靶基因的3’UTR可通过PCR获得,该方法引物设计时候需要在引物上添加相应的与载体合适的酶切位点和保护碱基(以人的GAPDH为例可选择NheI和XbaI两个酶切位点)。

也可通过化学合成的方法直接合成靶基因的3’UTR 并连入pmirGLO载体中,也需要用到相应的酶切位点。构建好的质粒可以命名为WT。

在WT的基础上通过点突变或者化学合成的方法构建MUT质粒。

需要根据miRNA的种子区序列将对应种子区序列结合的靶基因3’UTR的序列突变,使miRNA不能与MUT质粒上的靶基因的3’UTR结合,通常大部分文献中习惯将结合序列突变为对应的互补序列,例如:原结合序列为ACTAAGG,突变后序列为TGATTCC。

构建好WT和MUT质粒后进行相应的细胞转染,细胞的选择需要根据转染难易程度、内源性miRNA表达量等因素综合选择。


实验分组:

对照组:pmirGLO载体;pmirGLO载体+ miRNA mimics

WT组:WT质粒;WT质粒+ miRNA mimics

MUT组:MUT质粒;MUT质粒+ miRNA mimics

转染完成后利用双荧光素酶报告系统进行荧光素酶表达的检测,检测用的试剂盒比较通用的检测步骤如下:

下载 (3).jpeg

下载 (4).jpeg

检测结果大体是这样的:


下载 (5).jpeg

miRNA的基本实验套路就这么多了。


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