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如何选择合适的流式抗体?

流式细胞术是一种在液流系统中,快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质,并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术,其在细胞生物学、细胞凋亡研究和免疫学方面起着非常重要的作用。在流式细胞实验过程中,荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响着实验的数据质量。


随着流式细胞术的日益发展,流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多,加上多色分析实验方案需求的增长,逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题,如何选择合适的流式抗体,也成为了流式技术是否能成功的关键因素之一。



一、满足抗体具备的基本条件

确定所需检测的指标,目的细胞的特异性表面标记或胞内标记;


根据检测样本的种属选择抗体,流式抗体基本无法进行种属交叉反应;


根据抗体的说明,明确是否可以用于流式实验。



二、确定所使用仪器的参数配置

激光器:不同的流式细胞仪激光器不同,常见的有405nm,488nm和635nm,需要根据具体的仪器进行确定。


滤光片:检测通道的多少,决定最多可以同时检测几个指标。荧光素的发射波长与滤光片有关,所选择荧光素要在仪器的可检测范围内。


仪器:相同的荧光在不同的仪器上检测通道可能不同,需要参照仪器的说明。




三、荧光的选择

荧光有强弱之分,如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光,如PE、APC;反之,抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光例如FITC即可。常用荧光强弱排序程度为:PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC


四、多色荧光搭配

很多实验需要同时检测几个指标,此时就需要多个荧光标记进行搭配。流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的:流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。


能检测多少通道是又激光决定的需要注意所使用的仪器有哪些激光。每个检测通道只能选择1种荧光素,各通道之间的荧光素可以随意搭配,检测通道不能冲突。


如果需要做多个指标,而流式细胞仪能检测的通道不够,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别进行检测。


所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少,否则将会导致较大的补偿。例如,PE-Ccy5与APC同时标记,将会导致补偿过度,需换成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。



五、同型对照抗体

同型对照,是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色,类似于阴性对照,是流式细胞实验不可或缺的一项。


同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白,也要求使用相同剂量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1),同型对照则为Mouse IgG1-FITC.


如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗,那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体,如纯化的CD3+PE标记的二抗,则对照为纯化的同型对照+ PE标记的二抗。


有时候同型对照的表达会比抗体的表达高,首先检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次,因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。


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