Herve´ Boutal1, Anaı¨s Vogel1, Sandrine Bernabeu2, Karine Devilliers1, Elodie Creton2,3, Garence Cotellon2,3,Marc Plaisance1, Saoussen Oueslati2, Laurent Dortet2,3, Agne`s Jousset2,3, Ste´phanie Simon1, Thierry Naas2,3 and Herve´ Volland1*

1.Service de Pharmacologie et Immunoanalyse (SPI), CEA, INRA, Laboratoire d’Etudes et de Recherches en Immunonalyse, Universite ´ Paris-Saclay, F-91191, Gif-sur-Yvette, France;

2.EA7361, Universite´ Paris-Sud, Universite´ Paris-Saclay, LabEx Lermit, BacteriologyHygiene unit, AP-HP,Hoˆpital Biceˆtre, Le Kremlin-Biceˆtre, France;

3. Associated French National Reference Centre for Antibiotic Resistance: Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae, Le Kremlin-Biceˆtre, France

*Corresponding author. Tel: +33-1-69-08-78-98; Fax: +33-1-69-08-59-07; E-mail: herve.volland@cea.fr

产碳青霉烯酶的细菌在世界范围内的广泛播散给我们带来了巨大的经济压力，已然成为了一个全球共同关注的问题[1, 2]。在这些产酶耐药菌中，肠杆菌科细菌是医院感染的主要病原体（其中肠杆菌科细菌中的大肠埃希菌同时也是社区获得性感染的病原体）。产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE）往往是多重耐药菌，由其引起的感染，临床可用的抗菌药物选择非常少，有时候甚至无药可用[3, 4]。基于此，CPE毋庸置疑地成为了公共卫生事业的严重威胁。因此，快速检测及确诊CPE对临床医生及时采取有效感控措施、调整抗菌治疗方案以及改善预后等非常重要。根据氨基酸序列的不同，碳青霉烯酶可以分为三类，即Ambler分类的A、B和D型。碳青霉烯酶型别不一样对抗生素的水解活性也有差异，有的很弱、有的很强：比如，B类金属碳青霉烯酶对头孢他啶/阿维巴坦有很强的水解活性，而A类KPC型碳青霉烯酶却没有[5, 6]。因此，在临床诊治工作中非常有必要对酶型进行具体区分。

目前，临床微生物实验室主要在用的碳青霉烯耐药菌检测方法包括表型检测方法、分子检测方法及抗体包被检测技术等，不同的检测方法各有优势，也有一定应用局限性。根据检测细菌对碳青霉烯类抗生素的水解活性为原理的表型诊断方法有基质飞行质谱技术（MALDI-TOF MS）[7, 8]、生化反应试验（如Carba-NP试验及其改良的方法）[9, 10]、碳青霉烯类灭活实验（carbapenem inactivation method，CIM试验）[11]和OXA-48纸片试验[12, 13]等；此外，有研究者探索性地证明了其他在临床上较广泛应用的表型确认方法的价值性，但是缺点是耗时长，需要24小时完成，这些方法亦不能检测出具体的碳青霉烯酶型别[13, 14]。除表型检测方法外，分子诊断方法无疑弥补了这一缺陷，如终点PCR和实时荧光定量PCR。通过单通道或多通道PCR扩增实现对多种碳青霉烯酶基因型的直接检测，具有较高的灵敏度及特异性的优势[15-17]；然而这些方法价格昂贵，而且需要高水平的专业技术才能获得准确的结果，并不适合全球所有的临床微生物实验室。免疫层析法（lateral flow immunoassay，LFIA）是一种通过将不同型别的碳青霉烯酶抗体包被于固态基质上、根据抗原-抗体结合的原理实现对CPE及具体碳青霉烯酶酶型的检测方法[18-22]。LFIA法不能同时检测五种主要碳青霉烯酶，但具有快速——在15分钟内完成对纯菌落的直接检测，且100%灵敏度和特异性的显著优势。

根据目前的CPE耐药现状及临床需求，碳青霉烯耐药菌的耐药性检测方法应当同时具有价格便宜（较低的耗材和设备成本）和易于使用（较低的技术复杂性）两方面的优点。因此，本研究研发了一种基于LFIA原理的产品——Carba5。该试验检测五种主要的碳青霉烯酶家族，包括NDM、IMP、VIM、KPC以及OXA-48-like型。Carba5具有以下特点：便携、稳定（在无需冷藏的情况下可稳定超过24个月）、良好的用户体验（操作人员无需特殊培训）和优良的检测性能（高灵敏度和特异性）；相比于每个测试成本30~40欧元的分子方法，Carba5具有成本低廉的优势（虽然尚未明确价格，但类似的LFIA测试通常每个成本为10欧元）[20]。更重要的是，Carba5在不需要高技术设备的情况下，可以在短时间内得到检测结果。本研究纳入了296株肠杆菌科细菌，这些菌来自于法国国立菌株馆藏中心（Associated French National Reference Centre，F-NRC），其中180株为已知产β-内酰胺酶的菌株、116株为碳青霉烯耐药菌。通过Carba5对平板培养菌落进行直接检测，我们检出了185株菌表达NDM、IMP、VIM、KPC或OXA-48-like型碳青霉烯酶，并且所有的检测结果均于15分钟内完成。

1.医学伦理：本研究中所有实验均符合法国和欧洲动物实验标准（European Community Directive 86/609，French Law 2001-486，6 Jun 2001）及医学伦理标准。

2.受试菌株：本研究中有180株菌株为回顾性菌株，已经运用PCR确认过产β-内酰胺酶：55株非碳青霉烯酶产酶菌株和125株产碳青霉烯酶菌株。125株产碳青霉烯酶菌株中30株菌产的是A类碳青霉烯酶（KPC型22株、IMI型3株、SME型2株、NMC-A型1株、FRI-1型1株和GES-5型1株）、52株菌产B类金属-β-内酰胺酶（NDM型23株、VIM型17株、IMP型11株和GIM-1型1株）、38株菌为D类酶；还有5株菌株同时表达NDM型和OXA-48-like型碳青霉烯酶。D类酶中37株均为OXA-48-like型（OXA-48型21株，OXA-162型1株，OXA-181型3株、OXA-204型5株、OXA-232型2株、OXA-244型2株、OXA-517型1株、OXA-519型1株和OXA-535型1株）和1株为OXA-372型。我们运用Carba5对这些已知耐药机制的细菌进行碳青霉烯酶检测。

在前瞻性评估实验中，纳入了至少对一种碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的肠杆菌科细菌116株。这些菌株是由法国各个临床微生物学实验室于2017年4月至5月间分离、并寄到F-NRC的。

3.碳青霉烯酶活性测定及PCR/测序实验：分别用改良Carba-NP试验、PCR测序方法检测上述受试肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶活性[10]。

4.单克隆抗体制备：重组表达NDM-1（G29-R270）、OXA-48（K23-P265）、KPC-2（A30-Q293）、IMP-1（L22-N246）和VIM-1（A22-E266）等五种碳青霉烯酶，去除其C端his标签。分别以此五种碳青霉烯酶免疫10周龄Biozzi小鼠、筛选出适用于免疫层析法的单克隆抗体[19]。

5.Carba5试验方案：根据文献报道的方法，由NG Biotech公司生产用于多重免疫层析法的靶标抗体（见图1）[19]。首先将待检菌涂在Uriselec-TM 4或MH琼脂平板上，于37℃条件下过夜培养。第二天使用接种环挑取单克隆菌落，混悬在150μL提取缓冲液中进行裂解，随后吸取100μL混悬液加样在Carba5卡条的“S”孔中，室温下反应15分钟。商品化的检测试剂盒的操作流程于此流程一致。

6. 数据获取：获取数据分两种方法：（1）通过肉眼直接读取结果。阳性条带对应塑料检测板条上的型别为何种即为何种碳青霉烯酶型别。（2）通过计算机辅助读片及直接读取。可能的检测结果及解释见图2。

7. 统计分析：检测灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值运用统计软件vassarStats（http://vassarstats.net/）的95%CI值计算。实验金标准为PCR及测序，本研究结果直接推送到2012年至2015年全球法国流行病学数据库。

在应用Carba5检测之前，对于180株F-NRC的回顾性菌株，我们已经运用单抗体免疫层析法对四种NDM、IMP、VIM及OXA-48-like型碳青霉烯酶分别进行了检测（结果未展示）[19]。同期，我们也对F-NRC中心提供的60株产KPC碳青霉烯酶菌株进行了检测。这两部分结果均与参比方法PCR及测序进行比较，免疫层析法的灵敏度及特异性均高达100%。Carba5就是在此研究基础上发展起来的，可被应用于临床常规检测，测定对于至少一种碳青霉烯类抗生素耐药细菌的碳青霉烯酶酶型。

1.Carba5对回顾性研究菌株的验证结果：Carba5对于所有产OXA-48-like酶、KPC酶、NDM酶、IMP酶和VIM酶菌株均具有较高的灵敏度（强信号）。产OXA-48-like酶菌株共检测出37株，经PCR及测序确定的具体型别及菌株数分别为OXA-48（n=21）、OXA-162（n=1）、OXA-181（n=3）、OXA-204（n=5）、OXA-232（n=2）、OXA-244（n=2）、OXA-517（n=1）、OXA-519（n=1）和OXA-535（n=1）。产KPC酶菌株共计22株，分别为KPC-2酶（n=19）和KPC-3酶（n=3）；产NDM酶菌株共计23株，分别为NDM-1酶16株、NDM-4（n=2）、NDM-5（n=1）、NDM-6（n=1）、NDM-7（n=1）和NDM-9（n=2）；IMP 酶共计1 1 株， 分别是IMP-1（ n = 5 ） 、IMP-8（n=5）和IMP-11（n=1）；产VIM酶17株，VIM-1（n=12）、VIM-2（n=2）、VIM-4（n=2）和VIM-19（n=1）。此部分结果见补充表格S1。此外有5株同时表达NDM-1和OXA-181酶，结果显示两条阳性检测线。不产碳青霉烯酶菌株、单产碳青霉烯酶菌株及产多个碳青霉烯酶菌株的结果如图3所示。

结果中发现有3株产OXA-48-like酶菌株具有非常弱的碳青霉烯酶活性，这三株菌分别为OXA-163（n=2）和OXA-405（n=1），虽然此时Carba5结果也呈阳性，但是应被判定为假阳性。所有产非Carba5靶向酶的CPE菌株，其Carba5检测结果均为阴性。这些菌的碳青霉烯酶型包括8个A类酶：IMI（n=3）、GES-5（n=1）、NMC-A（n=1）、SME（n=2）和FRI-1（n=1），以及1个D类酶OXA-372（这是一种不属于OXA-48家族的D类酶）[23]和1个B类酶GIM-1。另外，51个不产碳青霉烯酶的菌株Carba5也未检测到阳性信号。

2. Carba5对前瞻性研究菌的评价：在本研究中，我们纳入了116株分离株进一步进行双盲比较分析，同时运用三种方法对这批细菌进行检测，包括Carba5免疫层析法、Carba-NP试验及PCR测序；以PCR测序结果为参比方法，比较前两种方法的检测价值及优劣势。结果显示，在不到15分钟的时间内，Carba5免疫层析法完成了70株碳青霉烯酶阳性菌株的检测（表1），分别对应的碳青霉烯酶型别为OXA-48-like型57株[OXA-48（n=52）、OXA-181（n=3）和OXA-244（n=2）]、NDM型9株[NDM-1（n=5）、NDM-5（n=3）和NDM-9（n=1）]、VIM型2株[VIM-1（n=1）和VIM-4（n=1）]和KPC-3型一株；此外检测到一株NDM和OXA-48（NDM-5和OXA-48）双阳性菌株；其他46个分离株的检测结果为阴性。Carba-NP试验耗时2小时，45株菌得到类似阴性结果。PCR测序结果显示有71株产碳青霉烯酶菌株，其中70株与Carba5和Carba NP试验结果一致，1株产IMI酶阴沟肠杆菌（一种非靶向碳青霉烯酶）仅Carba NP试验呈阳性；45例不产碳青霉烯酶菌株经PCR检测为阴性。

3. Carba5性能综合评价：Carba5免疫层析法对5种靶标酶检测的灵敏度和特异性分别达到100%（95% CI=95.8%-100%）和95.3%（95% CI=86.0%-98.8%）（2株OXA-163和1株OXA-405菌株被误判为阳性）。本试验能够检测同时表达两种碳青霉烯酶的菌株（如同时产NDM型和OXA-48-like酶的6株菌均被检测出来），重要的是未观察到与非靶标碳青霉烯酶（如IMI、SME、NMC-A、FRI、GES、GIM和OXA-372酶）、ESBLs酶（如TEM、SHV和CTX-M）、AmpCs酶（CMY-2、DHA-2和ACC-1）或苯唑西林酶（OXA-1、-2、-9和-10）等的交叉反应。在前瞻性研究中，Carba5的灵敏度达到100%（95% CI=93.5%-100%），特异性为100%（95% CI=90.4%-100%），阳性预测值为100%（95% CI=93.5%-100%），阴性预测值为100%（95% CI=90.4%-100%）。两种不同的平板（Mueller-Hinton/UriselecTM 4）对结果亦未产生干扰。

产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的流行播散已成为一个重要的公共卫生问题。从感染控制的角度来看，快速鉴定这类菌株对于防止其院内传播至关重要；此外，对于新型抑制剂/β-内酰胺类复合抗菌药物的应用，掌握具体碳青霉烯酶型别是正确使用这些新药的先决件。因此，对于CPE菌株的碳青霉烯酶型别进行鉴别，发展便捷、快速、准确的检测方法非常必要，Carba5免疫层析法正符合这一要求、满足所有层次患者的需求。

Carba5可以检测包括KPC、NDM、VIM、IMP以及OXA-48-like型在内的多种碳青霉烯酶，并且大多数情况下，能在15分钟内完成检测。与单次试验的LFIAs相比，Carba5在五种碳青霉烯酶间无交叉反应；对于同时产多个酶型时，Carba5也能准确检出。Carba5检测这五种碳青霉烯酶的灵敏度为100%，没有假阴性。此外，它还能检测OXA-48-like酶新的突变体，如OXA-517、OXA-519和OXA-535[24-26]。我们亦发现Carba5能检测出一些没有明显碳青霉烯酶活性的突变体，如OXA-163和OXA-405；对于这些酶的具体功能仍然需要进一步实验的证据。

对于这些特殊的OXA酶突变体，本研究中从180株菌株中发现了3株，这个比例或许有被夸大的可能性，因为在法国近4年分离到的10000株菌株中仅有1株菌为此种情况。因此，结合法国流行病学调查的数据，我们认为Carba5检测的特异性仍然达到99.98%（95% CI=99.90%-99.99%）。

本研究在对前瞻性研究的菌株进行评估时，71株产酶株中Carba5检测出了70株（98.6%），未发现IMI型碳青霉烯酶。考虑到IMI碳青霉烯酶在CPE中的携带率很低，这不应被视为一个产品缺陷。

在2012年至2015年间，F-NRC中心共计收到了9518株肠杆菌科细菌，其中3320株为产碳青霉烯酶CPE菌株。在这些CPE菌株中，有部分菌株已经明确了具体的碳青霉烯酶型别，包括118株KPC、13株IMI、1株FRI-1、366株NDM、115株VIM、10株IMP、2491株OXA-48、120株OXA-181、35株OXA-204、8株OXA-232、10株OXA-244及33株多重产酶菌株包括30株NDM+OXA-48-like、1株NDM+VIM和2株VIM+OXA-48-like等。根据LFIA的检测结果，我们认为除了个别产IMI以及产FRI-1（共计14株）酶的菌株，以及实验中唯一一株产OXA-405酶粘质沙雷菌，其余所有菌株在应用Carba5检测时都能得到准确的鉴定结果。总体来说，Carba5对5种主要碳青霉烯酶检测的灵敏度和特异性分别为100%（95% CI=99.86%-100%）和99.98%（95% CI=99.90%-99.99%），阳性及阴性预测值分别为99.97%（95% CI=99.80%-99.99%）和100%（95% CI=99.92%-100%）。若将14株携带非靶标酶的CPE菌株的检测结果定义为假阴性结果的话，Carba5对于所有CPE菌株检测的灵敏度及特异度分别为99.58%（95% CI=99.27%-99.76%）和99.98%（95% CI=99.90%-99.99%），阳性及阴性预测值分别为99.97% (95% CI=99.80%-99.99%) 和99.77%（95% CI=99.61%-99.87%）。

到目前为止，Carba5可以检测同一酶型的不同亚型碳青霉烯酶， 如NDM-1/4/5/6/7/9、IMP-1/8/11、VIM-1/2/4/19、KPC-2/3和OXA-48/162/181/204/232/244/517/519/535等亚型均能得到阳性检测结果；其次，Carba5优势是可在常规实验室进行检测，并于15分钟完成。另外，只要菌株有表达的靶标酶，就能被检测出来，从而解释其对于碳青霉烯类抗生素敏感性降低。我们也发现Carba NP试验在检测产NDM型酶的普罗维登菌属菌株时常常为阴性的检测结果，这些假阴性的Carba NP试验结果可能是由于碳青霉烯酶的表达水平较低或细菌外膜的通透性降低等原因；然而，对于这些菌Carba5能准确检测。此外，我们也发现不同平板对检测结果没有影响，如应用Carba5检测CPE筛选平板（如Carba-SMART）[27]上的单克隆培养菌并不影响检测结果，这表明Carba5是一种可靠的方法。

与其他LFIA方法相比，Carba5针对目前流行最广的五种碳青霉烯酶。它的推广将有助于及时反馈CRE的爆发及地区性流行。虽然碳青霉烯酶型别在不同国家不同区域之间存在区别，但这五种主要的碳青霉烯酶在每个国家占比都能超过99.5%，仅仅相对比例的差别，我们的方法适用于大多数的情况。为了证明这种方法的准确性及应用价值，以多中心的形式进行更大的规模验证仍然非常必要。目前，在某些OXA-48、KPC和MBLs高发国家，已经有临床验证实验在做了。

我们期望在不久的将来能将Carba5与CTX-M型酶的LFIA联合检测，这样就能提供更广谱的β-内酰胺酶检测手段，也能为临床抗生素的使用提供更多的实验室证据。

在临床微生物实验室，Carba5是一种易于在常规工作中开展，能高效、快速检测CPE的方法。它是现有碳青霉烯酶检测试验的完善和补充，特别是在资源有限和/或碳青霉烯酶肠杆菌科细菌高发的国家。快速、准确鉴定OXA-48-like和KPC型碳青霉烯酶可以为临床使用头孢他啶/阿维巴坦提供证据，不仅有助于预防抗生素的滥用，更能有效预防这些致命耐药细菌在医院环境中的播散。

致谢：我们感谢QuentinBaratte为我们提供所需单克隆抗体。

基金来源：本项目经费来源于the Assistance Publique—Hoˆpitaux de Paris (AP-HP), the University Paris-Sud, the Laboratory of Excellence in Research on Medication and Innovative Therapeutics (LERMIT) 、the French National Research Agency (ANR-10-LABX-33) 及the Joint Programming Initiative on Antimicrobial Resistance (JPIAMR) DesInMBL (ANR-14-JAMR-002).

透明度声明：L.D.是CarbaNP实验的共同研发者，该实验的专利属于生物梅里埃公司 (La Balmes les Grottes, France)。所有作者：无需声明。

补充数据：表S1见JAC Online的补充数据。

注：本文来源于《临床实验室》杂志2020年第10期“感染性疾病”专题