你一定要知道的微生物检测中培养基的质量控制措施_实验干货_实用技巧

培养基的制备和使用是微生物实验室检测工作的重要环节，培养基自身质量的优劣、保存是否得当、配制使用是否正确等都直接影响到检测结果的准确性。本文对微生物实验室在培养基购置、贮存、制备、使用等方面应采取的质量控制措施进行讨论，谈一些观点和看法。希望有助于微生物检测工作的小伙伴们更好地开展工作。

培养基，是指供给微生物、植物或动物（或组织）生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。

培养基的购置与验收

1、购置

从培养基自身的质量来看，不同生产厂家的产品，甚至同一厂家不同批号的产品都会存在差异。依据ISO/IEC17025《检测和校准实验室能力的通用要求》，对培养基的供应企业进行评价后选择合格的供应商，这是培养基购买过程中重要的步骤。应选择产品市场信誉度高、有质量保证能力和服务保证能力的企业；企业是否通过了质量管理体系的认证是较为客观的评价指标。

要求生产企业提供：培养基成分名称及产品编号、批号、使用前的pH、储藏信息和有效期、性能评价和所用测试菌株、技术数据清单、质控证书以及必要的安全/危害数据等材料。

2、验收

购买的培养基到货后，应有专人做好接受和验收工作，应仔细核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。每批培养基到货后都应对培养基的质量进行检测，满足检测方法规定的要求后方可投入使用。

培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；未开瓶的培养基在室温下的保存期限以厂家提供为准，开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并尽快用完。

应定期对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。

培养基的制备

1、培养基用水

培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，最好不使用离子交换器生产的去离子水。

2、称量

称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如有条件，尽量在湿度较低的房间称取培养基。

3、复水

复水时不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基。为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热。

烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去。

4、灭菌

一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，通常是121℃ 15 min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。

高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭菌。高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定，并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。

5、pH测定

微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH 值，即培养基使用前的pH，并应在25℃温度下采用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/L Na0H或 lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。

6、配制好的培养基保存

灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。

所配制的培养基的量，应该是在最长保存期限内正好使用完。含染料的培养基应闭光保存；倒好的琼脂平板如果配制的当天未使用完，应于冷藏保存，如果保存时间超过2天，应将其放入密封的塑料袋中保存；配好的肉汤类培养基如果保存时间超过2个星期，应将其放在带有螺旋盖的试管或其它密闭的试管或容器中防止蒸发。

培养基的性能测试

1、外观控制

制备好的培养基应有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化，是否蒸发/脱水。

2、污染控制

从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试（空白试验），确定无微生物生长方可使用。

3、性能测试

（1）测试菌株选择： 测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株，应来自国际/国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株或其他有证书的菌株。

（2）定量测试方法： 改良Miles-Misra法。测试菌株过夜培养物10倍递增稀释；测试平板和参照平板划分为4个区域并标记；从最高稀释度开始，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域；将稀释液涂满整个1/4区域，37°C培养18小时；对易计数的区域计数，按公式计算生长率（生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数/参考培养基平板上获得的菌落总数）。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1 。

（3）半定量测试方法：改进的划线法接种法。平板分ABCD四区，共划16条线，平行线大概相隔0.5cm，每条有菌落生长的划线记作1分，每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分，没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分，分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制，目标菌的生长指数G大于6时，培养基可接受。

（4）定性测试方法：平板接种观察法。用接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养，目标菌应呈现良好生长，并有典型的菌落外观、大小和形态，非目标菌应是微弱生长或无生长。

另外对选择性培养基还应选择被抑制生长的菌株进行培养基验收。

以下是一些实验室在制作培养基时候的经验总结：

1、培养基配方选择

同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。

2、培养基制备记录

每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

3、培养基成份称量

培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。

4、培养基成份的混合与溶化

培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置于高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。

5、培养基pH值的调正

pH因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行pH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH，保证培养基的质量。pH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。

6、培养基过滤澄清

液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。

琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。

即将冷却至55～60℃的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1～2个鸡蛋的蛋白，强力振摇3～5分钟，置于高压蒸汽灭菌器中、121℃加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。

7、培养基分装

培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎(现试管一般多有用螺旋盖者)。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为恰当。

分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。

8、培养基灭菌

一般培养基可采用121℃高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。

某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50℃左右的培养基中。

琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55-60℃时，摆成适当斜面，待其自然凝固。

9、培养基质量测试

每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。将全部培养基放入36±1℃恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。用有关的标准菌株接种1～2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。

（1）澄清度

水是细胞培养基的溶剂。细胞培养基中的营养成分只有完全溶解于水才能被细胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此细胞培养基是否溶解以及培养液是否透明澄清直接影响培养基使用。该项目是通过对水溶解后的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的澄清度。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅨB进行。

（2）pH值

哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，pH过高或者过低都会导致细胞死亡。pH值的测定也可以检查细胞培养基的批间差。清大天一标准规定取规定量供试品，用注射用水（水温20℃-30℃）溶解至1L，加入规定量碳酸氢钠到上述溶液中，用与细胞培养基溶液pH值相近的两点标准缓冲液校准后的酸度计进行测定。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅥH进行；加入规定量的碳酸氢钠到上述溶液中，按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅥH进行。

（3）干燥减量的质量分数

细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置水分会很快升高，干燥减量的质量分数表示产品中含湿量。细胞培养基是有菌制剂，其丰富的营养成分有利于微生物生长，控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养基的养分。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅧL干燥失重测定法进行。

（4）渗透压

溶剂通过半透膜由低浓度向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗透所需施加的压力，称为渗透压。细胞必须生活在等渗环境中，动物细胞借助K＋、Na＋维持渗透平衡。大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水萎缩，培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂，因此要控制培养基的渗透压范围。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅨG渗透压摩尔浓度测定法进行。

（5）细菌内毒素

细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。它的特殊性在于不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。培养基细菌内毒素过高，对生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程药品等注射用的药品都需要检查细菌内毒素。因此本项目的检验符合生物制品质量控制要求。

常规细胞培养基的细菌内毒素标准定为＜10EU/ml。称取本品规定量（见表4-12）的1/100，加入细菌内毒素检查用水10mL溶解，吸取该溶液0.1mL加细菌内毒素检查用水3.9mL，混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。

（6）微生物限度

细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基中的营养物质滋生繁殖，导致细胞培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌，是延长细胞培养基有效期的方法之一。

参考《中华人民共和国药典》2005版二部附录第100页的口服给药制剂的微生物限度标准，并严于该标准，规定细胞培养基产品的细菌数每1g不得超过200个，霉菌数每1g不得超过50个。称取样品1g，加入无菌纯化水10mL溶解，混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。

（7）细胞生长试验

这是一个性能特性表述的要求。细胞培养基的功能就是培养哺乳类动物细胞，因此经过细胞培养效果的检验是产品质量优劣的直观表述，这也是很多生物制药用户要求的一项指标。

目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法，可参考《体外培养的原理与技术》中细胞计数法论述的内容给出。按产品说明书配制培养液进行细胞培养，前四天用含10%小牛血清的培养液培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基是否有促生长的能力。后三天用不含小牛血清的培养液维持培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基中是否有不利细胞生长的毒素。本试验用细胞为VERO细胞。

10、培养基保存

培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。