实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。（源于百度百科）

由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，相对于其他免疫学方法具有独特的优势，如化学发光、蛋白芯片等。目前，qPCR技术被广泛应用于生物应用领域，多被用于疾病的早期诊断、药物研究、转基因食品等。在生物学领域，各种基因表达基本都不开1PCR的检测，但实验不可能总是一帆风顺的，偶尔就会出现一些意外情况。

下面一起来看看关于qPCR的意外情况及其原因吧！

意外1：无Ct值出现

出现这种情况通常有以下几点原因：

①操作步骤问题：SybrGreen法采用72 ℃延伸时采集，而Taqman法通常是延伸结束时或退火结束时采集；

②模板量不足或模板发生降解；

意外2：Ct值出现太晚

出现这种情况的原因可能是：

①扩增效率较低，应设计更好的引物或探针、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；

②PCR产物太长，通常产物长度为80-150bp；

意外3：标准曲线线性关系不佳

导致线性关系不佳情况的原因通常有以下几点，分别是：

①加样存在误差；

②引物或探针不佳；

③模板浓度过高或模板存在抑制物；

④标准品出现降解现象；

意外4：扩增效率较低

扩增效率低应从以下几方面分析原因：

①反应条件的优化程度；

②反应体系中是否存在PCR反应抑制物；

③是否发生部分成分降解，特别是荧光染料的降解；

意外5：扩增曲线发生异常

若参比染料的设定不准确、模板浓度过高、荧光染料的降解都会引起扩增曲线的异常

意外6：负对照出现信号

一般，出现这种情况从以下几点入手即可：

①引物设计优化问题；

②引物浓度问题；

③镁离子浓度过高；

④模板发生基因组污染；

以上就是qPCR实验操作中常出现的意外问题，大家只需对号入住进行查缺补漏即可，随着操作技术和熟练程度的增加即可逐步迈向qPCR大神啦！