琼脂糖是从琼脂中分离得到,由1,3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4连接的3,6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成,形成相对分子量为104~105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布,当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接,形成孔径结构,而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。
琼脂糖/% | 标准 | 高强度 | 低熔点 | 低粘度低熔点 |
0.3 | ||||
0.5 | 700bp~25kb | |||
0.8 | 500bp~15kb | 800bp~10kb | 800bp~10kb | |
1.0 | 250bp~12kb | 400bp~8kb | 400bp~8kb | |
1.2 | 150bp~6kb | 300bp~7kb | 300bp~7kb | |
1.5 | 80bp~4kb | 200bp~4kb | 200bp~4kb | |
2.0 | 100bp~3kb | 100bp~3kb | ||
3.0 | 500bp~1kb | 500bp~1kb | ||
4.0 | 100bp~500bp | |||
6.0 | 10bp~100bp |
由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用,因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化,如NaClO4能用于凝胶的裂解,一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。
随着实验技术的发展,也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶:
(1)低熔点琼脂糖凝胶,用于DNA片段的回收,且由于该种凝胶中无抑制酶,可在胶中进行酶切、连接等;
(2)高熔点凝胶,可分离小于1kb的DNA片段,专用于PCR产物的分析;
(3)快速凝胶,电泳速度比普通凝胶中快一倍,可节省实验时间;
(4)适用于DNA大片段的分离。
(5)其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶,可根据实验要求选择不同类型的,选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
问题 | 可能原因 | 解决方法 |
DNA Marker降解 | 核酸酶污染 | 每次吸取时更换灭菌枪头,勿将电泳缓冲液带入管中;用后密闭4°C保存 |
保存不当 | 4°C 或-20°C保存,避免多次反复冻融;不可加热 | |
DNA Marker无法正确分离 | 琼脂糖质量差 | 使用质量可靠的琼脂糖制胶 |
电泳缓冲液多次使用后失效 | 更换缓冲液 | |
条带黯淡 | 核酸浓度过低 | 增加上样量 |
核酸降解 | 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 | |
DNA条带被示踪染料掩盖 | 提高上样量;避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料 | |
条带模糊或弥散 | 电泳缓冲液多次使用后失效 | 更换缓冲液 |
核酸部分降解 | 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品 | |
核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 | 酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 | |
电压过低,电泳时间过长 | 根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳 | |
染色时间过长或拍照前放置过久,DNA条带弥散 | 电泳结束后及时观察、拍照 | |
条带缺失 | DNA条带分子量过大 | 使用脉冲凝胶电泳 |
分子量接近的DNA条带没有分开 | 选择适当的凝胶浓度进行电泳 | |
电泳缓冲液使用不当 | SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段,大片段分子不能完全分离;TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 | |
电泳时间过长或电压过高,DNA走出凝胶 | 缩短电泳时间,调整电压 | |
电极插反,DNA走出凝胶 | 正确连接电极方向 | |
条带大小不正确 | 核酸降解或形成聚合物 | 加热处理或重新制备样品 |
λ DNA酶切Marker的cos位点复性 | 电泳前65°C加热5分钟,冰上冷却5分钟以后再上样 | |
相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率 | 判断DNA分子是否有特殊结构,如缺口、超螺旋、二聚体等;富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢 | |
梳子变形,点样孔不在同一水平线上 | 使用完好的梳子制胶 | |
带型异常 | 不同样本的上样条件不同 | 选用相同的上样缓冲液,上样量尽可能接近 |
上样量过大或过小 | 选择合适大小的上样孔,样品应完全覆盖点样孔底部 | |
核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份 | 酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质 | |
电泳缓冲液未完全浸没凝胶 | 上样和电泳时,确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶 | |
电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性 | 根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳 | |
凝胶中加入EB造成染色不均 | 加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色 | |
凝胶中有气泡或污染物 | 使用纯水和洁净容器制胶;缓慢灌胶,并赶除气泡 | |
点样孔质量差 | 待凝胶完全凝聚后再取出梳子 | |
小片段扩散,条带模糊,粗 | 错误选择了低浓度凝胶,观察大片段用低浓度凝胶,观察小片段要用高浓度 | 比如观察100bp的小片段用2%凝胶跑电泳 |
琼脂糖质量不好,质量不好的琼脂糖分离小片段容易扩散,即使是使用高浓度凝胶 | 换用质量好的琼脂糖 | |
选择了不合适的电泳缓冲液 | SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段,大片段分子不能完全分离;TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段 |