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琼脂糖凝胶电泳常见问题分析

琼脂糖是从琼脂中分离得到,由1,3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4连接的3,6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成,形成相对分子量为104~105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布,当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接,形成孔径结构,而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。

琼脂糖/%

标准

高强度

低熔点

低粘度低熔点

0.3





0.5

700bp~25kb




0.8

500bp~15kb

800bp~10kb

800bp~10kb


1.0

250bp~12kb

400bp~8kb

400bp~8kb


1.2

150bp~6kb

300bp~7kb

300bp~7kb


1.5

80bp~4kb

200bp~4kb

200bp~4kb


2.0


100bp~3kb

100bp~3kb


3.0



500bp~1kb

500bp~1kb

4.0




100bp~500bp

6.0




10bp~100bp


由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用,因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化,如NaClO4能用于凝胶的裂解,一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。

随着实验技术的发展,也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶:

(1)低熔点琼脂糖凝胶,用于DNA片段的回收,且由于该种凝胶中无抑制酶,可在胶中进行酶切、连接等;

(2)高熔点凝胶,可分离小于1kb的DNA片段,专用于PCR产物的分析;

(3)快速凝胶,电泳速度比普通凝胶中快一倍,可节省实验时间;

(4)适用于DNA大片段的分离。

(5)其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶,可根据实验要求选择不同类型的,选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

问题

可能原因

解决方法

DNA Marker降解

核酸酶污染

每次吸取时更换灭菌枪头,勿将电泳缓冲液带入管中;用后密闭4°C保存

保存不当

4°C 或-20°C保存,避免多次反复冻融;不可加热


DNA Marker无法正确分离

琼脂糖质量差

使用质量可靠的琼脂糖制胶

电泳缓冲液多次使用后失效

更换缓冲液


条带黯淡

核酸浓度过低

增加上样量

核酸降解

使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品


DNA条带被示踪染料掩盖

提高上样量;避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料


条带模糊或弥散

电泳缓冲液多次使用后失效

更换缓冲液

核酸部分降解

使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品


核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份

酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质


电压过低,电泳时间过长

根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳


染色时间过长或拍照前放置过久,DNA条带弥散

电泳结束后及时观察、拍照


条带缺失

DNA条带分子量过大

使用脉冲凝胶电泳

分子量接近的DNA条带没有分开

选择适当的凝胶浓度进行电泳


电泳缓冲液使用不当

SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段,大片段分子不能完全分离;TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段


电泳时间过长或电压过高,DNA走出凝胶

缩短电泳时间,调整电压


电极插反,DNA走出凝胶

正确连接电极方向


条带大小不正确

核酸降解或形成聚合物

加热处理或重新制备样品

λ DNA酶切Marker的cos位点复性

电泳前65°C加热5分钟,冰上冷却5分钟以后再上样


相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率

判断DNA分子是否有特殊结构,如缺口、超螺旋、二聚体等;富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢


梳子变形,点样孔不在同一水平线上

使用完好的梳子制胶


带型异常

不同样本的上样条件不同

选用相同的上样缓冲液,上样量尽可能接近

上样量过大或过小

选择合适大小的上样孔,样品应完全覆盖点样孔底部


核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份

酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质


电泳缓冲液未完全浸没凝胶

上样和电泳时,确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶


电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性

根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳


凝胶中加入EB造成染色不均

加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色


凝胶中有气泡或污染物

使用纯水和洁净容器制胶;缓慢灌胶,并赶除气泡


点样孔质量差

待凝胶完全凝聚后再取出梳子


小片段扩散,条带模糊,粗

错误选择了低浓度凝胶,观察大片段用低浓度凝胶,观察小片段要用高浓度

比如观察100bp的小片段用2%凝胶跑电泳

琼脂糖质量不好,质量不好的琼脂糖分离小片段容易扩散,即使是使用高浓度凝胶

换用质量好的琼脂糖


选择了不合适的电泳缓冲液

SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段,大片段分子不能完全分离;TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段



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