RT-PCR、NGS……新生儿遗传病基因筛查技术如何选择？_临床医学_实用技巧

作者：文妍¹，郝虎^2*

作者单位：1. 广州市黄埔区精准医学研究院 2. 中山大学附属第六医院

^★通讯作者：郝虎

摘要

随着遗传性疾病相关检测技术和基因治疗药物研发的快速发展，新生儿遗传病筛查病种逐渐增多，临床价值也不断提升。其中，实时荧光定量、高通量测序等新兴技术开拓了新生儿遗传病的基因筛查新途径，其筛查结果也使得遗传病能够被更早期发现、早期诊断及治疗。同时需要关注的是，对于新生儿基因筛查，不仅要选择合适的病种纳入筛查应用，也要考虑检测技术的适用性。

新生儿遗传病筛查概况

出生缺陷是婴幼儿死亡的主要原因，也是儿童致畸致残的重要原因。

1961年美国Guthrie教授应用细菌抑制法检测干滤纸血片中苯丙氨酸的浓度对苯丙酮尿症（phenyl ketonuria，PKU）进行筛查。1973年Dussault等用通过干血滤纸片来测定新生儿末梢血甲状腺素，进行先天性甲状腺功能减低症（congenital hypothyroidism，CH）筛查。从而，以早期筛查PKU与CH为主要疾病的新生儿疾病筛查在欧美国家迅速掀起，并逐步向全球普及。

二十世纪九十年代，串联质谱技术开始应用于新生儿筛查^[1]。串联质谱技术可以一次检测氨基酸和肉碱等多种指标，同时筛查出氨基酸、脂肪酸和有机酸代谢异常等多种遗传代谢病，实现了从“一种实验检测一种疾病”到“一种实验检测多种疾病”的转变，大大提高了新生儿筛查的效率。

近年来，随着基因检测技术的迅猛发展、遗传医学研究的不断深入以及治疗罕见病药物的不断涌现和政策支持，对于遗传病的新生儿期早筛查、早发现、早干预拯救了无数患儿，极大地改善了他们的生存质量。新生儿筛查对提高人口素质、减少出生缺陷具有深远意义^{[1, 6]}{张瑞, 2019 #1;赵正言, 2014 #3}^{[1, 2][1, 2]}{赵正言, 2014 #3;顾学范, 2004 #4}。

新生儿基因筛查技术及应用

以往，新生儿筛查主要通过检测代谢物、激素或酶活性等标记物进行遗传病早期筛查。现今，笔者就两种目前应用最为广泛的检测技术及应用案例进行简单介绍。

2.1 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，q-PCR）是指在传统PCR反应体系中加入荧光基团，对目标DNA进行扩增并实现定量。q-PCR具有特异性强、效率高、操作简单以及自动化程度高等特点，适用于特定基因片段的快速检测。此类技术在传染病以及肿瘤领域应用较为广泛，如新冠病毒核酸检测、肿瘤早筛等。在遗传病检测中，由于绝大多数遗传病都由多个基因或多个变异位点引起，q-PCR目前主要用于部分致病突变位点较为集中，呈现热点现象的遗传病进行筛查及检测。例如，在非综合征型耳聋、脊髓性肌肉萎缩症、重症联合免疫缺陷病等疾病的筛查中均有应用。

应用示例：脊髓性肌肉萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）为常染色体隐性遗传的神经肌肉疾病，因位于染色体5q13区域的运动神经元存活1基因（SMN1）缺失或突变，导致SMN蛋白缺乏而致病，以脊髓前角运动神经元退化变性和丢失导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征。约95％的SMA患者由SMN1基因外显子7和/或8纯合缺失导致。Katharina等^[8]对165525名儿童进行筛查，共检出22例SMA患儿，检出率为1:7524，证明了SMA基因筛查的必要性，也说明了基于q-PCR方法筛查SMA的有效性。

2.2 高通量测序

高通量测序（Next generation sequencing，NGS）技术是通过将DNA片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中数以万计的DNA小片段进行并行测序，检测对应的信号，实现检测序列信息^[9]。随着NGS技术的发展以及测序成本显著下降，目前该技术已广泛应用于临床，例如无创产前筛查、肿瘤早筛、肿瘤靶向治疗、遗传性肿瘤检测、遗传病检测、病原微生物及宏基因组检测、胚胎植入前遗传学筛查和胚胎植入前遗传学诊断等领域^[10]。

NGS技术具有通量高，自动化水平高，单个碱基测序成本低等特点，可根据临床实际需求设计检测的基因数量及疾病覆盖范围，使新生儿基因筛查的应用更为科学和全面。另一方面，因NGS平台的特点及局限性，无法对假基因、高CG含量区域、动态突变及基因组拷贝数变异等进行准确检测，故基于NGS的基因筛查目前主要作为串联质谱技术筛查的互补检测与二阶筛查，此类联合筛查可有效降低串联质谱筛查的假阳性率和假阴性率，提高遗传性疾病的检出率。

目前，应用最多的基于NGS技术的新生儿基因筛查策略为靶向捕获测序，通过多重PCR或芯片捕获对几十个到几百个目标基因区域进行捕获测序及生物信息学分析以用于新生儿常见遗传病筛查或疾病辅助诊断。

基于靶向捕获测序的新生儿基因筛查（以下简称新生儿基因筛查panel）所筛查的基因的外显子区域仅占全基因组序列的1~2%，但包含了人类疾病约85%的变异。综合考虑经济效益、解读难度及检测周期等因素，可选择目标基因的外显子、外显子邻近区域、以及已知内含子致病/可能致病变异作为检测的靶标区域，可对绝大部分致病/可能致病变异进行覆盖。

新生儿基因筛查展望

新生儿常见的遗传性出生缺陷，如新生儿遗传代谢性疾病、各种新生儿期发病的单基因病等，可以通过基因筛查达到早期发现、早期治疗和早期干预的目的。单个病种发病率并不高，但是由于单基因病种类众多，整体累计发病率可高达1%。由单基因病所引发的婴儿死亡率约20%、儿科住院率约10%，因此三级预防尤为重要。

各种单基因病中，对于包含各种变异类型的新生儿基因筛查病种的检测，需要联合高通量测序技术、多重连接探针扩增技术（MLPA）、微阵列比较基因组杂交技术（array CGH）和CNV-Seq等基因分析技术进行检测，并不适用于大规模筛查。未来随着测序及分析成本的进一步下降，生物信息分析策略进一步优化以及基因数据库的不断积累，可以基于干血片一次性同时检出SNP及CNV的全外显子组检测技术以及全基因组检测技术会是未来新生儿基因筛查的有力工具^{[17, 18]}。

参考文献

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