一、基于细胞的体外药物敏感性检测技术的发展

随着精准医学在治疗领域的发展，肿瘤的个体化药物敏感性筛查逐渐得到研究者的重视。基于细胞的药物敏感性测试是肿瘤个体化治疗的评价手段之一。研究者普遍认为，如果待测的细胞毒性药物在体外测试体系中不能杀死肿瘤细胞，那么这种化疗药物应用于人体内也很难达到良好的肿瘤抑制效果6。基于这一理念，开启了根据药物作用后体外培养细胞的活力，判断白血病患者化疗药物敏感性检测方法的探索之路7-10。

1. DNA合成掺入法检测细胞增殖：肿瘤细胞具有高代谢的特征。DNA合成是细胞生长的必要条件，常被用来进行细胞增殖、细胞活力及凋亡的测定。其中放射性核素胸腺嘧啶（3H-TdR）掺入法为用同位素3H标记TdR作为DNA合成的前体，掺入DNA合成代谢的过程。通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况，用于化疗药物的敏感性预测11,12。Zittoun R等13,14曾研究53例AML患者体外培养的白血病细胞。通过放射自显影和液体闪烁计数检测DNA合成过程中3H-TdR的掺入情况，进而评估白血病细胞在体外对化疗药物的敏感性。研究发现，对化疗药物敏感的患者治疗前3H-TdR掺入率高。诱导化疗后获得缓解的患者，其体外培养的白血病细胞在两种诱导药物作用下3H-TdR掺入指数显著下降，下降程度高于对诱导化疗耐药的患者。这一发现体现了DNA合成代谢检测对于临床预后判断的重要性，并可以作为细胞毒性药物筛选的手段。但由于放射性元素对操作人员的损害，及实验废弃物需要特殊处理，使该方法较难在临床推广使用，并逐步被其他检测方式取代。BrdU（5-bromo-2'-deoxyuridine）与EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）为两种胸腺嘧啶核苷类似物，可掺入到新合成的DNA链中作为标记物用于检测细胞增殖，是一种新型的非放射性同位素细胞增殖检测方法，适用于临床药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定等15-18。DNA合成掺入法检测的局限是该方法仅能评估白血病细胞中一小部分具有高增殖性的白血病干细胞。

2. 集落形成法（HTCA）：1994年Lapidot等19首次通过特异性细胞表面标志分离出了人AML的白血病干细胞(LSC)，发现只有LSC才具有不断增殖、自我更新并维持其恶性侵袭性的能力。LSC虽仅占白血病细胞的1%左右，却成为疾病复发及髓外播散的根源。白血病细胞在体外适当的环境条件下进行培养，其中具有增殖能力的干细胞可以在半固体培养基上形成集落。因此，研究者认为检测化疗药物体外干扰LSC集落形成能力的试验研究可以为临床提供药物治疗敏感性的依据。Chan H. Park等20评价了体外培养的白血病细胞持续给予化疗药物作用，其克隆形成情况与临床治疗反应的相关性。在21例蒽环类药物与ARA-C联合化疗的患者中，相应的体外集落形成实验提示11例完全缓解患者中的8例对化疗敏感，10例未缓解患者中7例体外实验耐药。该方法预测体外药物敏感性与临床治疗的符合率达71%。集落形成法的优势在于直接测定化疗药物对于白血病细胞中最活跃的成分，即LSC的作用效果。但由于操作繁琐，难以标准化，且耗时较长（培养时间2周左右）不能早期指导临床治疗，因此不适用于临床常规应用。

3. 四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）：早在1989年，J.M.Sargent首次报道21采用MTT法评估体外培养的白血病细胞对化疗药物的敏感性。其原理是活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶将可溶性的黄色唑盐还原为不溶的蓝紫色结晶甲瓒，沉积于细胞内。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，通过分光光度计在570nm波长处测定吸光值来间接反映活细胞的数量。

2001年，日本学者S Yamada进行了一项儿童AML体外化疗药物敏感性与体内疗效的相关性研究22。骨髓或外周血样本取自132例初诊AML儿童患者，经分离提取获得的白血病细胞在体外培养。不同浓度的13种待测化疗药物加入白血病细胞培养体系。4天后，采用MTT法检测细胞活力，评估药物在体外对白血病细胞的杀伤能力。结果表明，诱导缓解失败的患者体外实验即表现出对阿糖胞苷、依托泊苷、阿柔比星等药物显著的耐受性。该方法应用于AML可以快速帮助临床医生筛选有效的化疗药物及组合，并且可以在治疗过程中根据结果调整用药，尤其有助于缓解后复发患者筛选到有效的化疗药物。其特点是检测方法简便、成本低，但准确性较差，灵敏度较低，无法区分肿瘤细胞与正常细胞，且该方法中的有机溶液对对检测操作者有损害。

4. 荧光微培养细胞毒性测定（The fluorometric microculture cytotoxicity assay, FMCA）：FMCA是一种基于微孔板培养的非克隆形成性细胞活力测定法，用于体外测量不同药物的细胞毒性和/或抑制细胞生长的作用。该测定基于具有完整质膜的细胞中酯酶对探针二乙酸荧光素（FDA）的水解作用，产生具有荧光的极性物质，该荧光物质不能透过细胞膜溢出，因此检测荧光物质可以反映细胞的活力及数量。用少量药物溶液制备药物培养板，将细胞接种在平板上，培养2-4天后采用FDA溶液孵育，在485/520nm波长处检测荧光强度，评估细胞活力23。该方法敏感度较MTT法高24，且孵育时间短，有利于观察细胞活力水平的变化，还可同时观察细胞形态学改变。

Larsson R25的研究采用FMCA法检测了来自35名白血病患者的43份骨髓/外周血样本，通过分析一组药物的作用结果发现白血病细胞在体外对各种化疗药物的反应存在显著的异质性。从慢性淋巴细胞白血病和AML患者体内获得的样本在体外对标准化疗药物的敏感性与已知的临床治疗情况相符合，该测定方法检测到原发性和获得性耐药。结果表明，FMCA在鉴定化疗药物耐药性方面具有高度特异性，可能成为是一种简单，快速的方法，适用于白血病患者的化疗药物敏感性测试。FMCA法也有一定的缺点和局限，FDA探针测定受PH值变化的影响较大，影响细胞内PH值的药物可能会干扰FDA的测定结果；此外FDA还受到血清中酯酶的影响，实验前需要洗去细胞外酯酶以保证实验结果的准确性。

5. 三磷酸腺苷（ATP）生物荧光法：Rhedin AS利用生物发光ATP测定法评价抗白血病药物的体外细胞毒性作用能力26。该方法是将白血病细胞与化疗药物孵育培养后，培养体系中加入的荧光素-荧光素酶复合物与细胞内的ATP发生氧化反应而产生光子，通过监测荧光来检测ATP含量，从而分析细胞活性与增殖。ATP含量与荧光强度呈正比，从而反映白血病细胞对化疗药物的敏感性。

2018年Swords RT进行的一项队列研究27，采用体外药物敏感性检测平台对12名难治性AML患者进行评估。由215种美国食品药品监督局批准的抗癌化合物及药物组成的检测体系与经纯化后的AML患者骨髓白血病细胞在体外孵育72小时后，通过检测作用体系中ATP的水平，反映药物作用后白血病细胞的活性，给出药物敏感性评分。研究结果显示，3/5药物敏感性检测指导下化疗的患者表现出良好的临床疗效，而经验性治疗的患者均在治疗过程中出现疾病进展。因此，对于复发难治性AML患者，体外药物敏感性实验可以快速、有效的为患者提供个体化治疗的参考依据。采用ATP生物荧光法检测的优势为检测体系敏感、准确性高，稳定性好，易于操作，临床应用前景良好，缺点为耗时较长，并不适用于临床上发病急、病情重的急性白血病患者。

6. 细胞毒性差异染色法（differential staining cytotoxicity, DiSC）：Weisenthal28创立的DiSC法是评价细胞毒药物总体细胞杀伤情况的方法，可以应用于实体瘤及血液肿瘤29-31。该测定方法的基本原理是靶细胞与待测药物体外孵育培养结束后，加入一定数量的鸭红细胞至待测细胞组分中作为内参计数标准，通过快绿染料进行死活细胞的差异染色，涂片镜检，确定药敏实验中药物的杀伤效率。

P Staib等32,33采用DiSC方法检测了83例AML患者的骨髓样本，并与患者实际治疗后临床效果进行一致性评价。结果发现55例完全缓解患者及19例部分缓解患者（化疗后骨髓中白血病细胞比例小于10%）的临床化疗用药中，每位患者至少有一种药物经DiSC试验结果提示为敏感药物。而9例不缓解患者的DiSC试验结果显示对全部测试药物耐药。该方法总体预测化疗药物作用的精确性为100%，有望为临床提供个体化药物治疗的参考。DiSC法的优势在于通过结合形态学观察，可以区分培养体系中的正常细胞及恶性细胞，对于白血病药敏的预测与临床符合率较高。缺点是方法操作较复杂，且耗时较长，阅片计数易受主观因素影响。

上述这些技术体外培养过程类似，均为分离纯化的单个核细胞的体外杀伤实验，只是用于检测培养体系中细胞活力的方法不同。DNA掺入法和集落形成法的结果仅能反映少量增殖活跃的LSC细胞对药物的敏感及耐受情况；MTT法中，存活细胞将MTT转化为甲瓒，通过分光光度法定量。生物发光ATP测定是基于代谢活性测量细胞的ATP含量。FMCA法检测活细胞的胞内荧光。这些方法的共同点是检测实验终点培养体系中的所有活细胞，而不区分白血病细胞和正常细胞，故上述方法不能准确反映药物对白血病细胞的作用效果。DiSC虽能通过形态学辨别良恶性细胞，但由于依赖人工镜检，对阅片者经验和技术要求较高，且工作量大，难以实现多种药物、多个浓度梯度药物作用效果的测试。因此，瑞典科学家Mollgard L.建立了一种采用流式细胞术评价体外药物敏感性作用效果的检测方法34。经过分离培养的单个核细胞在体外与药物共同孵育4天后，采用碘化丙啶联合CD13, CD33多色荧光标记，流式细胞术检测药物作用后存活的髓系细胞，这种方法可以选择性评价细胞毒性药物对目的细胞的杀伤作用。

二、全自动流式细胞技术检测白血病细胞体外药物敏感性

流式细胞术体外药物敏感性检测平台被称为PharmaFlow35。该平台以白血病免疫分型为基础，将流式细胞术白血病免疫表型分析与药物敏感性实验相结合36。实验前分析患者白血病相关免疫表型（Leukemia Associated Immunophenotype，LAIP），之后患者骨髓样本与8个浓度的各种化疗药物体外孵育培养48至72小时。收集细胞，根据LAIP特征采用流式细胞术分析存活的白血病细胞数，通过与未加药物组对比，计算各药物浓度作用下白血病细胞的生存指数，绘制药物剂量反应曲线，直观反映药物对患者白血病细胞的杀伤能力。通过一定数量样本的积累形成数据库，建立群体药物反应数据模型，形成对患者体外药物敏感性检测的定量评估，利于临床的推广和应用。

该技术平台采用全骨髓或外周血样本进行体外药物试验，减少细胞分离过程中的机械损伤。同时，体外药物作用体系中保留红细胞及血浆蛋白成分，在接近生理功能状态下对药物作用效果进行精确评估。该平台采用多色流式细胞术对药物作用效果进行检测分析。借助单克隆抗体及Annexin-V标记药物作用后存活的白血病细胞群并可对该目标群体进行精确计数。自动化的流式细胞术检测通量高，允许检测多个浓度的多种药物及组合，从而获得单药及组合用药的药物剂量反应曲线。此外，PharmaFlow平台数据分析使用群体药效学数据模型，使所有患者的药理学数据同时吻合。这大大提高了个体患者药理学价值的准确性。

目前，国内外学者已利用PharmaFlow平台开展多项AML药物敏感性评价的临床研究。Martinez-Cuadron D 等37评价123例初诊AML患者采用“7+3”诱导化疗方案的治疗效果与体外药物敏感性实验预测结果的相关性。将患者全骨髓样本在体外与阿糖胞苷（Ara-C）、去甲氧柔红霉素（IDA）及其组合药物共同孵育培养48小时，采用群体药效学模型评价化疗药物作用效果。结果发现，最具临床预测价值的评价参数为Ara-C及IDA的单药药物剂量反应曲线下面积，曲线下面积大与临床对该药物化疗效果不佳相关联。体外药物敏感性预测与临床治疗效果的一致性高达81%，该方法的阴性预测值（93%）显著高于阳性预测值（60%），即PharmaFlow平台对化疗药物治疗有效的患者预测准确性更高。经过对患者的长期随访观察，PharmaFlow预测对“7+3”诱导敏感的患者生存期较耐药患者显著延长。Megias-Vericat JE等38在189例初诊AML患者中采用PharmaFlow平台进一步评价了米托蒽醌（MIT）、柔红霉素（DAU）及去甲氧柔红霉素（IDA）三种蒽环类化疗药物体外细胞毒性作用的差异。研究结果显示三种药物呈现相似的平均药物剂量反应曲线，其中IDA的EC50（引起培养的白血病细胞减少50%的药物浓度）显著低于MIT及DAU,但三种药物作用效果均显示较大的个体间差异。三种药物作用效果的配对比较发现，其中28.3%的患者对不同蒽环类药物的反应差异大于30%。提示在临床选择一线化疗药物时，PharmaFlow平台能帮助近1/3的患者筛选到更加敏感有效的诱导化疗药物组合。

近年来，PharmaFlow技术引入中国，并逐步开展了一系列的研究及平台优化。Lihui Lin等39报道了38例AML患者骨髓样本经PharmaFlow平台测试7种化疗药物及6种药物组合的体外药物敏感性的临床评价。结果显示大多数测试药物及组合在体外均能显著清除白血病细胞。评估的药物敏感性与患者化疗至缓解所需的时长显著相关。当以PharmaFlow分数89.4作为阈值时，体外药物敏感性试验预测结果与临床疗效的一致性为84.2%。较依据细胞遗传学及分子生物学危险度对AML的分层治疗，PharmaFlow平台展现出更精准的个体化评价优势，并且提供治疗药物选择的依据。该研究将体外药物作用时间由原来的48小时延长至72小时，改善了部分药物如：Ara-C, DAU, MIT等在短时间内无法观察到药物将病变细胞全部清除的实验终点。此外，该研究进一步评价了10例继发/复发AML患者的体外药物敏感性，PharmaFlow测试预测其中8例患者对临床实际使用的化疗药物抵抗，另外2例患者敏感。结果临床观察到此8例患者均未获得二次缓解，而预测敏感的2例患者中有1例在第二轮化疗中获得缓解。对继发及复发AML患者的研究提示，此类患者对大多数临床使用的化疗药物普遍耐药，而PharmaFlow平台的治疗前药物筛选可以为临床提供有价值的建议，有利于改善患者的预后及生存。

三、根据基因表达特征预测诱导化疗敏感性

依据基因突变及细胞遗传学异常进行危险度分层的2017欧洲白血病网（European LeukemiaNet，ELN）诊断及治疗指南4提示，部分高危组患者的基因突变如TP53, ASXL1, RUNX1, FLT3-ITD等与其预后不良相关，表现为化疗难治及复发等特征。Brown FC等40研究发现SETBP1, ASXL1及RELN基因突变与AML患者的原发耐药高度相关。近年随着分子生物学技术的快速发展和测序通量的提高，对AML患者基因表达数据分析及应用的能力也不断增强。尤其对白血病细胞转录组数据的分析，评估相关敏感性及耐药基因的表达情况，预测患者对相应化疗药物的反应。

Okutsu J等41通过DNA芯片技术对50名采用标准诱导化疗方案治疗的AML患者基因表达数据进行分析。比较诱导化疗缓解组与耐药组的基因表达差异。当相对表达情况在一半以上患者中增高大于3倍，则定义为该基因过表达，相反，相对表达率减低至1/3以下，则该基因表达受到抑制。通过筛选，在32例敏感患者及12例耐药患者中找到28个显著差异表达的基因。基于此28个基因的表达情况，建立了评价患者个体化疗药物敏感性的算法，用于药物敏感性评价的预测。在20例测试患者中，其中9例预测敏感的患者在第一轮化疗结束后即获得完全缓解，8例预测耐药的患者在第二轮化疗结束后仍未获得缓解，因此，该方法预测AML化疗药物敏感性的准确率高达85%（17/20）。该研究提示，有望通过检测一组特异性基因，筛选适合的化疗药物以实现个体化治疗。在临床上，年老、白细胞增多症、高风险的细胞遗传学异常等特征与AML的“7+3”诱导化疗方案预后不良相关42。Yu Chiao Chiu等43分析了52例初发AML患者骨髓样本的RNA测序数据，比较患者经“7+3”标准诱导方案治疗后缓解（35例）和未缓解（17例）患者基因表达的差异。经过基因功能聚类分析发现mTOR、myc、线粒体氧化磷酸化及白血病细胞干性与患者的化疗耐药呈显著相关，可结合此四种功能预测AML患者对化疗药物的耐药性（预测模型ROC曲线下面积为0.815）。该研究进一步筛选得到此四种功能对应的7个特异性基因（CNOT7、DCUN1D4、EXOSC2、FKBP4、NDUFA8、PRDX4、RPS27A），根据基因表达积分情况构建化疗药物敏感性预测模型，预测患者对“7+3”诱导方案的敏感性。基因表达积分≥-0.027为“7+3”诱导方案的独立预后不良因素，建议采取其他方案进行化疗。针对上述7个基因的RNA测序组合或定量PCR分析，可以实现对AML“7+3”诱导化疗效果的预测评价。

四、分析与展望

化学药物的优点是，分子量较小，分子结构、药效学和药代动力学清晰，运输、储存和使用方便，因而成为疾病治疗的首选药物。但是，化学药物进入机体发挥作用，受到体内多种因素的影响，其体内应答、量时效关系、代谢、毒副反应和耐药的发生和程度却因人而异，差别很大。为了解决这些问题，科学家进行了极大的努力，包括药物研发者对疗效好的药物不断优化药物的结构、剂型和载药体，以提高其药效，降低毒副反应、延缓耐药的发生，新型化学药物迭代二生。而血液病受到造血细胞类型复杂、分化阶段不同和两谱系及以上细胞异常并存等因素影响，化疗药种类与剂量的可选择范围比较窄，体外评估体内药效就成为化疗药物个体化应用的渴望和。经过几十年的努力，体外药物试验评估体内疗效已经获得了长足进展，预测符合率从30%左右提升到敏感符合率83%，耐药符合率100%，对临床用药无疑是很大的支撑。随着检测技术的发展，信息化、智能化的推进，本技术将在积累更多临床治疗和实验结果，建立中国人自己的数据模型之后，准确性将会不断提升。临床用药指导后的长期效果观察也将对该方法做出客观评价。同时，检测技术本身经过不断提升，在更准确模拟体内环境、更快获得结果和更低成本方面的优化、改进，一个精确检验指导下的精准AML治疗方案将为临床和患者展现低毒、高效的治疗前景。我们也期待在此基础上，以化疗为主的其他血液病药物指导模型尽快研发成功，为临床提供依据，造福更多患者。也期待该技术能更好地用于AML化疗期间耐药和复发监测，期待导致血液病不良结局的微小残留病变更敏感、更特异的检测技术的诞生。 

作者：蔺丽慧 李莉

单位：上海交通大学附属第一人民医院检验医学中心

参考文献略

注：本文来源于《临床实验室》杂志2020年第12期“回顾与发展”专题