有的人第一想到的就是抗体的原因，其实大多数大厂家的抗体都具有高灵敏度、高特异性的，因此除了考虑一抗的因素，还有可能是下面的这些原因：

1. 出现黑点或黑斑

原因：

(1)一般出现这种情况可能是封闭液溶解不完全或封闭液存放时间太久；

(2)抗体中可能存在杂质；

(3)试剂污染；

解决方法：

(1)过滤封闭液或选用其他类型封闭液；

(2)与其他品牌已验证过好用的抗体处理相同样本，作比较，看是否还有斑点；

(3)更换试剂；

2. 条带中出现边缘规则的白圈

原因：

(1)转膜时膜和胶中间有气泡;

(2)抗体在膜上未均匀分散；

解决方法：

(1)制备“三明治”时用玻璃棒赶去气泡；

(2)使用摇床孵育抗体；

3. 条带扭曲，如微笑带

原因：

(1)胶未配好（凝胶未能完全聚合，胶中有颗粒或气泡，凝胶未冷却好；

(2)电压过高；

(3)上样量过大或胶孔中的液体体积不同，差别很大；

解决方法：

(1)正确添加质量合格且未过期的AP及TEMED；

(2)过滤配胶的试剂保证配胶过程中胶内无气泡；

(3)凝胶冷却好后再上样；

(4)降低电压；

4. 条带中间出现白色（反白）

原因：中心部位高浓度HRP将底物消耗过快，中间部位底物消耗完后无法发光

解决方法：

(1)降低蛋白量;

(2)降低一抗与二抗的浓度

5. 高背景（杂带多）

原因：

(1)抗体溶度过高；

(2)曝光时间过长；

(3)封闭不完全；

解决方法：

(1)降低抗体溶度，设置不同抗体溶度比进行预实验；

(2)减少曝光时间；

(3)更换封闭液的种类，或是调整封闭液的浓度；